2017, Vol. 37 
2. 华东师范大学化学与分子工程学院, 上海 200241
2. College of Chemistry and Molecular Engineering, East China Normal University, Shanghai 200241, China
代谢组学是当今的研究热点，可以定义为定量或半定量检测生物体中内源性代谢物，并寻找代谢物与病理变化和基因改变的相互关系的研究方式[1]。它以研究细胞、体液和组织中内源性代谢物的生物化学变化来进行生理药理评价、疾病诊断和预防等等[2]。代谢组学方法为生命科学的发展提供了有力的现代化实验技术手段，同时也为新药临床安全性评价与实践提供了新的技术支持与保障[3]。代谢组学中糖类的研究尤为重要，糖类又称碳水化合物，是自然界存在最为广泛的一类有机化合物，几乎存在于所有生物体的关键结构和功能部位中[4-6]。过去的几十年里，越来越多的研究人员将研究焦点转向糖类的细胞功能和它在疾病中的作用的研究，这些研究为传染病、神经系统疾病、癌症和代谢紊乱开辟了许多以多聚糖为靶点的新型药物或者疗法[7-8]。糖类物质存在各种复杂异构体且极性较强，使得这类化合物的分离极具挑战性。糖类物质在常规反相色谱柱上几乎不保留，洗脱时间接近色谱柱死时间，导致其无法分离[9]，为此人们开发了一些替代方法：如离子交换色谱[10]和多孔石墨碳液相色谱[11]等。Alpert于1994年[12]首次提出的亲水色谱（HILIC）成为了糖类分离的新兴技术[13-15]。HILIC分离体系对极性化合物的良好保留以及与质谱较高的兼容性，使其越来越多的被应用于各种极性化合物的定量研究。
现代分析技术，特别是液质联用（LC-MS/MS）分析技术的发展，为药物体内代谢产物的分析鉴别提供了简便快速的分析方法。LC-MS/MS技术结合了液相色谱的高分离能力和质谱提供结构信息的功能，具有灵敏度高及选择性强的优势，同时可以获得丰富、有效的化合物结构信息，进而建立快速、高效、准确的分析研究体系[16]。为了满足定量代谢组学同时对十几种内源性糖类定量分析的需求，本研究采用了HILIC-UHPLC-ESI-MS/MS系统并基于亚乙基桥杂化颗粒三键键合酰胺基（BEH Amide）色谱柱开发了一种快速测定人尿液中15种内源性糖类化合物的定量方法。
1 实验部分 1.1 仪器Waters UPLC自动进样器（Waters公司），串联API4000三重四极杆质谱仪（AB Sciex公司）；Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm；填料：亚乙基桥杂化颗粒三键键合酰胺基）；Waters ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm Van-Guard预柱（Waters公司）；Sartorius CPA225D十万分之一电子分析天平（Sartorius公司）；Eppendorf 5810R全自动高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；IKA MS3圆周振荡器（IKA公司）；QB-9006恒温微孔板快速振荡器（江苏其林贝尔公司）；Milli-Q纯水仪（Millipore公司）。
1.2 试剂乙腈、甲醇、甲酸（纯度99.5%）为色谱纯，醋酸铵和氨水（≥25%NH3）为分析纯。对照品葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、木糖、核糖、棉子糖、楝二糖、肌苷、腺苷、甘露糖醇、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇和内标拉米夫定为色谱纯，均购自Sigma-Aldrich公司。L-甲硫氨酸13C5，15N（99%）购自CIL公司。活性炭购自Sigma-Aldrich公司。实验用水为Milli-Q超纯水。
1.3 标准储备液及工作曲线配制分别称取一定量的对照品置于4 mL棕色安瓿瓶中，用纯水将其溶解，配制成10~100 mmol·L-1的储备母液，所得储备液均于-80 ℃保存备用。实验时，按照一定比例混合，并用70%乙腈稀释配制标准曲线，所有化合物按其质谱信号响应及在体内的浓度分为3个不同浓度等级的线性范围，A组：0.001~10 μmol·L-1；B组：0.01~100 μmol·L-1；C组：0.1~1 000 μmol·L-1，每组标准曲线对应的低、中、高3个不同浓度的QC，A组：0.5 μmol·L-1（LQC）、2 μmol·L-1（MQC）和10 μmol·L-1（HQC）；B组5 μmol·L-1（LQC）、20 μmol·L-1（MQC）和100 μmol·L-1（HQC）；C组：50 μmol·L-1（LQC）、200 μmol·L-1（MQC）和1 000 μmol·L-1（HQC），如表 1所示。
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表 1 各化合物标准曲线及质控溶液中浓度信息 Table 1 The composition of mixtures A, B, C and the concentrations in calibration solutions |
所有尿液样品均取自健康成年人。实验采用活性炭吸附技术[15, 17-18]除去其中内源性目标化合物即可获得空白基质。即将不同个体来源的尿液等体积混合后，按照0.04 g·mL-1的比例加入活性炭，震荡30 min后4 ℃离心（13 000 r·min-1）20 min，取上清液经质谱检测确保其中内源性目标化合物全部被除去。如未完全去除，需重复上述步骤。
从-80 ℃冰箱中取出尿液样品，置于4 ℃解冻。取100 μL样品至EP管中，向其中加入预冷的含有内标（2 μmol·L-1拉米夫定和10 μmol·L-1甲硫氨酸同位素）的沉淀剂甲醇-乙腈（50:50，v/v）500 μL，涡旋1 min后置于-20 ℃孵育20 min，4 ℃离心（13 000 r·min-1）15 min，取300 μL上清液于96深孔板中。再次4 ℃离心（4 000 r·min-1）15 min，取上清液进行样品分析。
1.5 液相色谱和质谱条件色谱条件：采用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（亚乙基桥杂化颗粒三键键合酰胺基）色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相A为含10 mmol·L-1醋酸铵的水-乙腈（95:5，v/v），流动相B为含10 mmol·L-1醋酸铵的乙腈-水（95:5，v/v），洗脱梯度（0~6 min，98%B→60%B；6~8 min，60%B；8~8.1 min，60%B→~98%B；8.1~10 min，98%B，流速0.25 mL·min-1），柱温60 ℃，进样体积10 μL。
质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），多通道反应监测（MRM），负离子模式，喷雾电压-4.5 kV，离子源温度550 ℃，气帘气压力（CUR）206.8 kPa，碰撞气压力（CAD）68.9 kPa，雾化气压力（GAS1）413.7kPa，辅助气压力（GAS2）413.7 kPa，射入电压（EP）-50 V，碰撞室射出电压（CXP）-10 V。15个碳水化合物和内标离子对及相关参数见表 2。本实验所有数据采集及处理均基于美国AB Sciex公司提供的分析软件Analyst 1.5完成。
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表 2 15个糖类和内标质谱相关参数 Table 2 Mass spectrometry parameters of fifteen carbohydrates and internal standards |
为提高灵敏度，本实验对各化合物质谱参数进行优化。大部分化合物仅在负离子模式下有响应，且母离子[M-H]-的丰度最高。在子离子扫描模式下选择丰度较高、干扰最小的碎片离子作为子离子，在MRM模式下，进一步对各化合物的去簇电压（DP）和碰撞电压（CE）值等参数分别进行优化，多反应监测模式下各参数如表 2所示。离子源参数优化，包括喷雾电压、离子源温度（TEM）、气帘气压力（CUR）、碰撞气压力（CAD）、雾化气压力（GS1）、辅助气压力（GS2）等，优化后参数见“1.5”项。
2.2 液相条件优化 2.2.1 色谱柱选择本实验首先选择了两款常用于极性化合物分离的反相色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm；填料：三键C18烷基键合高强度硅胶颗粒）和Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，4.0 μm；填料：极性端基封尾的C18烷基键合硅胶颗粒），由于碳水化合物极性太大，在该类色谱柱上几乎不保留、分离度较差；后选择了Atlantis Silica HILIC色谱柱（2.1 mm×150 mm，5.0 μm；填料：未键合高强度硅胶颗粒），该色谱柱虽然能够对碳水化合物有保留，但分离度及峰形较差，其pH耐受范围仅为1~5，大大限制其应用范围。ACQUITY UPLC BEH Amide Column因其特殊的分离机制、较宽的pH耐受范围（2~11），特别是针对碳水化合物所表现出的良好分离效果，使其成为本研究的最佳选择。
2.2.2 流动相组成及柱温优化由于BEH Amide色谱柱分离机理较为复杂，本实验首先对流动相种类进行优化，当选用质子溶剂甲醇作为有机相洗脱液时，峰形展宽，分离度低，而用非质子溶剂乙腈时，该现象消失。本实验后续优化实验，基于水-乙腈的流动相体系分别对流动相中缓冲盐浓度、pH和色谱柱柱温进行优化。
实验比较了流动相中不同醋酸铵浓度（0、1、5、10、15 mmol·L-1）对化合物分离和信号响应的影响，结果发现大部分化合物信号响应随醋酸铵浓度升高而降低，而化合物峰形及分离度随醋酸铵浓度的增加而变得更好，特别是具有相同离子对的同分异构体，最终在较高浓度的醋酸铵流动相体系中得以完全分离。主要原因有二：1）流动相中醋酸铵的浓度提高，抑制了部分碳水化合物在ESI源的电离，导致信号降低；2）流动相中醋酸铵的浓度加大，增加了Amide色谱柱固定相表面的极性水层的厚度，使得化合物和色谱柱之间的作用更加充分，同时也降低了离子交换作用力的影响，最终分离效果更好，峰形更加对称，甚至一些化合物的响应随之增加。实验中还观察到当醋酸铵浓度增至15 mmol·L-1时，有机相中有醋酸铵晶体析出。综合考虑，流动相中醋酸铵浓度最终设定为10 mmol·L-1。
实验对流动相的不同pH（3.0、7.0、9.8）进行考察。酸性流动相中糖类物质的峰形较差，因碳水化合物存在α和β端基异构，之间互相转换，酸性条件下，2种形式互变较慢，实验中容易出现分叉峰；虽然碱性条件下，峰形较好，但大部分化合物的信号响应有所下降。最终选择在中性流动相条件下分析该类化合物，此时大部分化合物峰形和响应最好，如图 1所示。
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图 1 流动相中不同pH条件对化合物信号的影响 Figure 1 The effect of different pH values on the compounds' signal |
在考察不同色谱柱柱温（30、40、50、60 ℃）对目标化合物的色谱行为的影响时发现，柱温对部分糖类物质的峰形影响较大，这也与α和β端基异构之间互相转换速度有关。当温度升高时，该互变异构转换速度加快，在色谱图中出现1个较对称、尖锐的色谱峰且信号响应增加。但柱温升高的同时会导致部分化合物信号降低（如图 2所示），另外还影响色谱柱的使用寿命及稳定性，多方面考虑本实验柱温最终设定为60 ℃。
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图 2 不同柱温对化合物信号的影响。 Figure 2 The effect of different column temperatures on the compounds' signal. |
尿液是生物体排出的代谢废物和毒素，成分比较复杂，其中包含大量的盐和少量的蛋白，对目标化合物的检测产生影响，必须经过样品前处理才能进入质谱分析。本实验采用蛋白沉淀法分别对6种溶剂系统进行考察：甲醇、乙腈-甲醇（25:75，v/v）、乙腈-甲醇（50:50，v/v）、乙腈-甲醇（75:25，v/v）、乙腈、甲醇-乙腈-丙酮（1:1:1，v/v/v），比较各条件下的待测物的信号响应及峰形。各化合物在甲醇中的溶解度比乙腈中高，甲醇含量越高，提取后的上清液杂质越多，越容易造成目标化合物信号抑制。乙腈沉淀效果比甲醇好，但容易造成蛋白结团和目标化合物溶解度不好，导致回收率不稳定。另外，该实验所有化合物的分离是基于BEH Amide色谱柱进行的，该体系下，待测上清液中质子溶剂（水、甲醇等）比例越高，越容易造成色谱峰峰形变宽，此时的分离度和灵敏度均降低。综合考虑，最终选择乙腈-甲醇（50:50，v/v）作为本实验的沉淀剂。
利用上述优化好的条件进行样品分析，各化合物及内标色谱图如图 3所示。
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1.核糖（ribose），tR=3.06 min 2.木糖（xylose），tR=3.83 min 3.果糖（fructose），tR=4.22 min 4.葡萄糖（glucose），tR=4.82 min 5.麦芽四糖（maltotetraose），tR=7.31 min 6.拉米夫定（lamivudine），tR=2.61 min 7.腺苷（adenosine），tR=3.18 min 8.肌苷（inosine），tR=3.80 min 9.蔗糖（sucrose），tR=5.60 min 10.棉子糖（raffinose），tR=6.65 min 11. L-甲硫氨酸13C5，15N（methionine），tR=4.63 min 12.楝二糖（melibiose），tR=6.30 min 13.麦芽三糖（maltotriose），tR=6.74 min 14.赤藓糖醇（erythritol），tR=3.18 min 15.阿拉伯糖醇（arabitol），tR=3.99 min 16.甘露糖醇（mannitol），tR=4.66 min 17.麦芽糖（maitose），tR=5.95 min a.空白基质加标（carbohydrates in treated matrix）b.尿液样品（endogenous compounds in the urine sample） 图 3 15个碳水化合物以及2个内标的色谱图 Figure 3 Chromatograms of fifteen carbohydrates and two internal standards |
由于待测化合物均为内源性物质，在自然界中不存在天然的空白基质，必须选择合适的替代基质用于构建标准曲线和方法验证。早期用水或者磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline）作为替代基质使用，但因其成分差异较大，容易造成定量不准，目前较少使用。本实验通过活性炭吸附法除去尿液中目标待测物，所获基质较接近真实样品，该吸附后基质被用于本实验的方法验证与定量分析。
2.4.1 方法专属性、标准曲线及灵敏度为考察基质中的内源性物质对目标化合物的干扰情况，实验对吸附后的空白基质、吸附后基质加标样品及真实尿液样品进行前处理、进样并比较其色谱图。在本实验中，内标、吸附后基质对所有化合物不产生干扰，各离子通道中糖类物质出峰位置并未出现明显的干扰峰，且标准曲线呈良好的线性关系；真实样品中各化合物出峰位置和标准曲线中一致，且无分叉峰出现，说明该方法专属性较高。
以尿液中各化合物的浓度为横坐标，化合物峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，加权重因子1/X2进行回归运算得到线性和相关系数。大部分化合物相关系数r均能满足r > 0.99，最低检测限和定量限通过计算获得，信噪比（S/N）分别为3:1和10:1，各化合物具体参数详见表 3。结果表明，该方法线性关系良好且检测灵敏度高。
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表 3 15个糖类化合物方法验证相关参数 Table 3 Fifteen carbohydrates parameters of method validation |
取低、中、高3个浓度质控样品，按优化后的样品前处理办法进行处理，每个浓度平行6个样品，连续测试3 d，考察其日内及日间精密度，用RSD表示，日内及日间精密度RSD范围分别为2.5%~7.6%和3.3%~7.3%，如表 4所示，该数据表明仪器精密度高、方法重复性好。
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表 4 15个碳水化合物的日内、日间精密度，基质效应及回收率 Table 4 The intra-and inter-day precision, matrix effect and recovery of 15 carbohydrates |
该糖类化合物为内源性物质，且替代基质为活性炭吸附后的基质，本实验基质效应既考察了一定量的高浓度质控溶液（HQC）在吸附后的基质及纯溶液中各化合物信号的差异，又考察了在样品及吸附后基质中各化合物的信号差异，其大部分化合物比值范围在80%~120%之间（见表 4）。回收率实验中，以实测浓度与理论添加浓度之比计算各被测物的方法回收率，如表 4所示，其范围为85.5%~115%。
2.4.3 样品稳定性及保留时间稳定性低、中、高3个不同质控样品经前处理后，其上清液于4 ℃放置72 h，考察其72 h内稳定性。与新鲜配置的0 h样品一起进行检测，各化合物浓度C变化范围为93.1%~106%，表明上清液在4 ℃下72 h内稳定。1 d内连续进样6次来考察保留时间稳定性，保留时间差异用RSD表示，其范围为0~0.34%，表明该方法较稳定，重复性好。数据如表 5所示。
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表 5 15个碳水化合物在尿液上清液中4 ℃的稳定性 Table 5 The stability of 15 carbohydrates in urine extract stored at 4 ℃ |
运用本方法对20例健康人尿液样本进行定量分析，15个待测糖类化合物中有12个糖类化合物能被检出，检测结果用“平均值±标准误差”（mean±SE）表示，如表 6所示。
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表 6 人尿液中15个化合物的浓度（平均值±标准误差，n=20） Table 6 Concentrations of fifteen carbohydrates inhuman urine(mean±SE, n=20) |
本研究中由于天然基质中存在的内源性待测物会干扰检测，需要寻找替代基质，实验采用的活性炭吸附法可有效去除其中的内源性物质，得到的空白基质和待测样品更为接近但不干扰检测。实验对质谱、色谱条件、样品前处理过程进行优化，并基于BEH Amide色谱柱建立了人尿中15个内源性糖类化合物的HILIC-MS/MS定量检测方法，该方法具有高效、灵敏、快速，样品前处理简单等优点，满足定量代谢组学对尿液中糖类化合物的定量分析要求，特别对代谢组学后期的靶标验证、糖类代谢研究以及疾病代谢机理研究具有重要意义。
| [1] |
NICHOLSON JK, LINDON JC, HOLMES E. 'Metabonomics':understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J]. Xenobiotica, 1999, 29(11): 1181. DOI:10.1080/004982599238047 |
| [2] |
LINDON JC, HOLMES E, BOLLARD ME, et al. Metabonomics technologies and their applications in physiological monitoring, drug safety assessment and disease diagnosis[J]. Biomarkers, 2004, 9(1): 1. DOI:10.1080/13547500410001668379 |
| [3] |
王斯婷, 李晓娜, 王皎, 等. 代谢组学及其分析技术[J]. 药物分析杂志, 2010, 30(9): 1792. WANG ST, LI XN, WANG J, et al. Metabonomics and its analytical technique[J]. Chin J Pharm Anal, 2010, 30(9): 1792. |
| [4] |
DWEK RA. Glycobiology:toward understanding the function of sugars[J]. Chem Rev, 1996, 96(2): 683. DOI:10.1021/cr940283b |
| [5] |
DOVE A. The bittersweet promise of glycobiology[J]. Nat Biotechnol, 2001, 19(10): 913. DOI:10.1038/nbt1001-913 |
| [6] |
HAKOMORI S. The glycosynapse[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(1): 225. DOI:10.1073/pnas.012540899 |
| [7] |
SEEBERGER PH, WERZ DB. Synthesis and medical applications of oligosaccharides[J]. Nature, 2007, 446(7139): 1046. DOI:10.1038/nature05819 |
| [8] |
BLOW N. Glycobiology:a spoonful of sugar[J]. Nature, 2009, 457(7229): 617. DOI:10.1038/457617a |
| [9] |
DUNN WB, ELLIS DI. Metabonomics:current analytical platforms and methodologies[J]. TrAC-Trends Anal Chem, 2005, 24(4): 285. DOI:10.1016/j.trac.2004.11.021 |
| [10] |
BORROMEI C, CAVAZZA A, CORRADINI C, et al. Validated HPAEC-PAD method for prebiotics determination in synbiotic fermented milks during shelf life[J]. Anal Bioanal Chem, 2010, 397(1): 127. DOI:10.1007/s00216-010-3510-5 |
| [11] |
RUHAAK LR, DEELDER AM, WUHRER M. Oligosaccharide analysis by graphitized carbon liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Anal Bioanal Chem, 2009, 394(1): 163. DOI:10.1007/s00216-009-2664-5 |
| [12] |
ALPERT AJ. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds[J]. J Chromatogr, 1990, 499(2): 177. |
| [13] |
LEIJDEKKERS AG, SANDERS MG, SCHOLS HA, et al. Characterizing plant cell wall derived oligosaccharides using hydrophilic interaction chromatography with mass spectrometry detection[J]. J Chromatogr A, 2011, 1218(51): 9227. DOI:10.1016/j.chroma.2011.10.068 |
| [14] |
HERNANDEZ-HERNANDEZ O, CALVILLO I, LEBRON-AGUILAR R, et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with mass spectrometry for the characterization of prebiotic galactooligosaccharides[J]. J Chromatogr A, 2012, 1220(1): 57. |
| [15] |
ZHU BJ, LIU F, LI XT, et al. Fast quantification of endogenous carbohydrates in plasma using hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry[J]. J Sep Sci, 2015, 38(1): 34. DOI:10.1002/jssc.201400899 |
| [16] |
姜艳彬, 单吉浩, 王莹, 等. LC-MS/MS技术在药物代谢研究中的应用进展[J]. 药物分析杂志, 2014, 34(3): 385. JIANG YB, SHAN JH, WANG Y, et al. Application progress on LCMS/MS technology in drug metabolism research[J]. Chin J Pharm Anal, 2014, 34(3): 385. |
| [17] |
MERBEL NCVD. Quantitative determination of endogenous compounds in biological samples using chromatographic techniques[J]. TrAC Trends Anal Chem, 2008, 27(10): 924. DOI:10.1016/j.trac.2008.09.002 |
| [18] |
SAMTANI MN, JUSKO WJ. Quantification of dexamethasone and corticosterone in rat biofluids and fetal tissue using highly sensitive analytical methods:assay validation and application to a pharmacokinetic study[J]. Biomed Chromatogr, 2007, 21(6): 585. DOI:10.1002/(ISSN)1099-0801 |