抗骨增生丸为国家基本医疗保险药品目录收载品种，是由熟地黄、淫羊藿、骨碎补等9味中药制成的蜜丸，临床广泛用于增生性脊椎炎、颈椎综合症、骨刺等骨质增生症^[1]。熟地黄、淫羊藿、骨碎补均为该复方制剂的主要药味，其主要活性成分毛蕊花糖苷为苯乙醇苷类化合物，淫羊藿苷和柚皮苷为黄酮类，功能主治与该制剂功能主治相一致。该制剂现行标准^[2]仅对淫羊藿苷进行含量测定，未能全面控制其质量，且国内尚未见对抗骨增生丸中毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷3种有效成分含量同时进行质量控制的报道及文献。笔者参考相关文献[2-7]，采用HPLC法同时测定抗骨增生丸中3种成分，有利于产品质量控制和临床用药的安全有效。

1 仪器与试药

安捷伦公司Agilent 1260高效液相色谱仪（VWD检测器），安捷伦公司LC solution工作站，安捷伦公司Agilent ZORBAX SB-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）色谱柱，梅特勒-托利多仪器有限公司AG-135电子分析天平，山东济宁恒通超声电子设备有限公司HT-300BQ超声仪，岛津公司Shimadzu UV-2450紫外分光光度计。

对照品毛蕊花糖苷（批号111530-201512，含量96.7%）、柚皮苷（批号110722-201312，含量94.7%）、淫羊藿苷（批号110737-201516，含量94.2%）均购自中国食品药品检定研究院。

抗骨增生丸（大蜜丸，每丸重3 g）为吉林龙泰制药股份有限公司产品，批号150804、151102、151104。

甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

采用Agilent C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相A为水，流动相B为甲醇，流动相C为乙腈，按表 1程序进行线性梯度洗脱，流速1.0 mL·min^-1，检测波长270 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品溶液

分别取毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷的对照品适量，精密称定，用50%甲醇水溶液溶解并定量稀释制成质量浓度分别为0.508、0.756、0.513 mg·mL^-1的混合溶液，作为混合对照品储备溶液；精密量取混合对照品储备溶液2 mL置20 mL量瓶中，加50%甲醇水溶液稀释至刻度，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

样品剪碎，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇水溶液50 mL，称量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）45 min，放冷，用50%乙醇水溶液补足减失的量，摇匀，滤过，续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液

按处方量制备缺熟地黄、淫羊藿和骨碎补的样品，同供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

精密量取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL，分别注入色谱仪，记录色谱图，见图 1。结果理论塔板数按毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷计算均不低于3 000，3种成分色谱峰与相邻峰之间分离度均大于1.5，对称因子在0.95~1.05内，样品中其他成分不干扰待测成分的测定。

2.4 线性关系考察及检测限测定 2.4.1 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品储备溶液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 mL，分别置25 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，即得系列混合对照品溶液；照上述色谱条件进样测定，记录色谱图；以峰面积Y对质量浓度X（μg·mL^-1）进行线性回归，得到3种待测物的回归方程、相关系数，结果见表 2。

2.4.2 检测限

以“2.4.1”项下浓度最低的混合对照品溶液逐级稀释，依法进行测定，当信噪比为3:1时，计算毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷检测限分别为0.21、0.31和0.14 ng。

2.5 精密度试验和重复性试验

取样品批号为150804的供试品溶液连续进样6次，记录色谱图，毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面积的RSD（n=6）分别为0.54%、0.69%和0.96%，表明本法精密度良好。取样品（批号150804），制备供试品溶液6份，进样分析，以外标法计算含量，毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷平均含量分别为1.18、1.82和1.41 mg·丸^-1，RSD分别为1.0%、0.8%和0.6%

2.6 稳定性试验

取样品（批号150804），依法制成供试品溶液，每隔4 h进样1次，共7次，记录色谱图，毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷峰面积的RSD（n=6）分别为0.78%、0.55%和0.81%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 加样回收率

取用本法已测知含量的样品（批号150804）剪碎，取约2.0 g共9份，精密称定；每3份为一组，分别精密加入混合对照品储备溶液4、5、6 mL，按供试品溶液制备方法处理，按上述色谱条件测定，计算回收率。结果见表 3，表明本方法准确度良好。

2.8 样品测定

取3批样品（批号150804，151102，151104）各3份，按照本文方法制备供试品溶液并测定，以外标法计算含量，结果见表 4。

3 讨论 3.1 流动相选择

由于各成分性质差异较大，为了使毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷3个成分都达到良好的分离，笔者分别考察了不同比例的乙腈-水、乙腈-0.1%醋酸水溶液等流动相系统^[8-11]，结果分离效果均不甚理想。如以乙腈-水（20:80）两相系统为流动相时，毛蕊花糖苷、柚皮苷出峰好，但淫羊藿苷保留时间过长，而且杂质分离效果差，峰形较差；经过进一步的对比研究，最终选择甲醇-乙腈-水三相系统为流动相梯度洗脱，可消除杂质对被测成分的干扰，各成分的色谱峰峰形对称，理论塔板数高，分离度好，缩短了多成分检测的分析时间。

3.2 检测波长选择

取毛蕊花糖苷、柚皮苷、淫羊藿苷对照品溶液，以初始比例流动相为空白，在200~400 nm进行紫外扫描，兼顾多种成分的最大吸收，重点考察334、283、270 nm波长。实验发现，在283 nm波长处，毛蕊花糖苷吸收较低，334 nm波长处，柚皮苷吸收较低，而在270 nm波长处，3种成分都有较强吸收，因此，选择淫羊藿苷的最大吸收波长270 nm作为检测波长，可同时得到较好的色谱峰，并能满足定量测定的要求。

3.3 提取方法的选择

笔者分别对回流提取法、冷浸法、超声法进行了考察^[12-14]。结果显示，回流提取1 h基本提取完全，但提取温度较高，可能对其活性成分产生较大的影响，活性成分含量均有不同程度的降低^[15]；而冷浸法提取时，为获得较好的效果，需不定期振摇，且浸泡时间长，提取效率较低；超声法可在30 min内基本提取完全，具有提取时间短，提取温度低，提取率高等特点。综合提取方法及各检测成分的特点，最终选用超声提取法提取。对超声处理时间15、30、45、60 min进行考察，结果表明，超声处理30 min后各成分含量不再增加，考虑到样品的差异性，选择超声处理45 min。在提取溶剂方面，分别考察了乙醇、50%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、甲醇，结果表明50%甲醇水溶液和50%乙醇水溶液超声提取完全且杂质干扰峰较少，结果差异不大，但甲醇毒性较乙醇大，且从经济实用的角度，故提取溶剂选择50%乙醇水溶液。

3.4 小结

本实验通过HPLC法梯度洗脱，能快速、准确地对抗骨增生丸中毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷同时进行定量测定，可为抗骨增生丸质量标准进一步完善提供参考。