2017, Vol. 37 
2. 新疆第八师石河子市药品检验所, 石河子 832000;
3. 和田维吾尔药业有限责任公司, 和田 848200
2. Xinjiang Eighth Division of the Shihezi Institute of Drug Inspection, Shihezi 832000, China;
3. Hotan Uygur Pharmaceutical Co., Ltd., Hotan 848200, China
热感赛比斯坦颗粒是维吾尔民族治疗感冒的传统验方，处方由破布木果、罂粟壳、罂粟籽、大枣、甘草等12味药组成，收载于1998年版《中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册》[1]，其处方中有毒药材罂粟壳和罂粟籽，主要药效成分是生物碱类，分别为吗啡、可待因、罂粟碱，具有显著的镇痛、镇咳作用[2-3]。在现有部颁标准中只对罂粟壳与罂粟籽进行了定性鉴别，而关于热感赛比斯坦颗粒的含量测定未列入标准。贺金华等[4]对热感赛比斯坦颗粒中的吗啡进行了定量分析，其样品提取方法比较繁杂，本研究对其进行简化并对流动相以及溶剂进行了优化，能够同时对热感赛比斯坦颗粒中另外2种生物碱可待因、罂粟碱进行HPLC测定。
1 仪器与试药Waters e2695高效液相色谱仪，配有Waters e2695分离单元、2998二极管阵列检测器、Empower色谱工作站和打印机（Waters公司）；xBridge®Shield RP18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Waters公司）；雷磁PHS-3C精密PH计（上海精密科学仪器有限公司）；移液枪（Eppendorf公司）；AR124CN电子天平（OHAUS公司）。
热感赛比斯坦颗粒（批号20150602、20150711、20150910）由新疆和田维吾尔药业有限责任公司提供；对照品吗啡（批号171201-201123）、磷酸可待因（批号171203-201005）和盐酸罂粟碱（批号171214-201205）均购于中国食品药品检定研究院，甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照品储备液精密称取吗啡对照品5.85 mg，用含5%醋酸的20%甲醇水溶液定容至25 mL量瓶中，制成0.237 6 mg·mL-1的吗啡对照品储备液。精密称取对照品磷酸可待因5.69 mg、盐酸罂粟碱5.58 mg，分别用乙腈定容至25 mL量瓶中，制成0.227 6 mg·mL-1的磷酸可待因对照品储备液和0.223 2 mg·mL-1的盐酸罂粟碱对照品储备液。
2.1.2 供试品溶液取本品约4.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨水4 mL，充分湿润，放置10 min，加三氯甲烷30 mL超声（功率250 W，频率40 kHz）30 min，取20 mL蒸干浓缩，加甲醇定容至10 mL量瓶中，摇匀，即得吗啡供试品溶液。取本品约5.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加75%乙醇20 mL超声30 min（功率250 W，频率40 kHz），即得可待因、罂粟碱供试品溶液。
2.1.3 阴性对照品溶液按处方比例及工艺自制不含罂粟壳、罂粟籽的阴性制剂。取阴性制剂约4.5 g，按“2.1.2”项下方法制备阴性对照溶液。
2.2 色谱条件吗啡：采用xBridge®Shield RP18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾和0.05 mol·L-1庚烷磺酸钠混合水溶液（pH 3.1）（2:98）为流动相，流速1 mL·min-1，检测波长220 nm，柱温28 ℃，进样量20 μL；可待因、罂粟碱：采用xBridge®Shield RP18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾和0.05 mol·L-1庚烷磺酸钠混合水溶液（pH 3.8）（B）为流动相进行梯度洗脱（0~18 min，2%A→40%A；18~25 min，40%A→52%A），流速1 mL·min-1，柱温28 ℃，可待因的检测波长220 nm，罂粟碱的检测波长257 nm，进样量20 μL。在上述色谱条件下，吗啡、磷酸可待因、盐酸罂粟碱的对照品、样品及阴性样品色谱图见图 1、2。
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1.吗啡（morphine） 图 1 吗啡对照品（A）、样品（B）及阴性样品（C）色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substance of morphine(A), sample(B)and negative control(C) |
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1.可待因（codeine）2.罂粟碱（papaverine） 图 2 磷酸可待因和盐酸罂粟碱对照品（A）、样品（B）及阴性样品（C）色谱图 Figure 2 HPLC chromatograms of reference substances of codeine phosphate and papaverine hydrochloride(A), sample(B)and negative control(C) |
取“2.1.1”项下对照品储备液适量，用乙腈定容至10 mL量瓶中，分别制得吗啡质量浓度为11.88 μg·mL-1的对照品溶液，盐酸罂粟碱和磷酸可待因质量浓度分别为11.38 μg·mL-1和22.32 μg·mL-1的混合对照品溶液。在“2.2”项色谱条件下分别取不同体积上述溶液进样测定。以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归，回归方程见表 1。
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表 1 吗啡、磷酸可待因和盐酸罂粟碱的回归方程及线性范围 Table 1 The regression equations and linear ranges of morphine, codeine phosphate and papaverine hydrochloride |
取同一吗啡对照品溶液及磷酸可待因和盐酸罂粟碱混合对照品溶液，连续进样6次进行测定，记录峰面积，计算吗啡、可待因和罂粟碱峰面积的RSD（n=6）分别为0.79%、0.77%、0.73%，RSD≤2.5%，表明方法精密度良好。
2.5 重复性试验取同一批样品（批号20150910）6份，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，计算样品中吗啡、可待因和罂粟碱平均含量（n=6）分别为0.038、0.389、0.227 mg·g-1，RSD分别为2.2%、2.0%、0.82%。
2.6 稳定性试验取同一份供试品溶液，室温放置，分别在一天内不同时间（0、2、4、6、8、12 h）以及分别在0、1、2、3、4、5 d进样测定，记录峰面积；计算12 h内吗啡、可待因和罂粟碱峰面积的RSD（n=6）分别为0.32%、0.81%、0.34%，5 d内吗啡、可待因和罂粟碱峰面积的RSD（n=6）分别为1.1%、2.3%、0.90%，RSD均≤2.5%，表明供试品溶液在日内、日间稳定性良好。
2.7 回收率试验取同一批号热感赛比斯坦颗粒（20150602）6份，每份约0.5 g，精密称定，分别精密加入“2.1.1”项下对照品储备液适量，按“2.1.2”项方法制备供试溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算各成分的加样回收率和RSD，结果见表 2。
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表 2 加样回收率试验结果（n=6） Table 2 Results of recovery test |
取3批样品各3份，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.2”色谱条件进样测定，记录峰面积，以外标法计算样品中吗啡、可待因、罂粟碱含量。结果见表 3。
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表 3 3批样品含量测定结果（mg·g-1，n=3） Table 3 Results of content determination in three batches of samples |
在《中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册》中，关于热感赛比斯坦颗粒标准仅对罂粟壳和罂粟籽进行定性鉴别，对于该制剂的药品质量和安全性难以进行有效控制，所以本实验采用高效液相色谱法测定了制剂中吗啡、可待因和罂粟碱的含量[5-6]，为该药临床使用安全有效提供理论依据。
3.2 样品处理方法的选择查阅文献[7-9]测定吗啡、磷酸可待因和盐酸罂粟碱时选择含5%醋酸的20%甲醇水溶液、乙腈作为溶剂，结果表明以5%醋酸的20%甲醇水溶液作为溶剂时，溶剂对可待因和罂粟碱的出峰有影响，而吗啡峰形良好。而选择流动相乙腈作为溶剂时，发现可待因和罂粟碱峰形良好，故以5%醋酸的20%甲醇水溶液作为吗啡的溶剂，而乙腈作为磷酸可待因和盐酸罂粟碱的溶剂。在制备供试品溶液时，考察了75%乙醇和氨水湿润之后加三氯甲烷作为提取方法，结果表明以75%乙醇提取制得的供试品溶液的色谱图中吗啡的峰形不好，而氨水湿润之后加三氯甲烷制得的供试品溶液的色谱图中吗啡峰形良好且峰面积比前者的大，故后者作为吗啡供试品溶液的制备方法。
3.3 HPLC流动相的选择查阅文献[10-12]，考察流动相乙腈-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液、乙腈（A）-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾和0.05 mol·L-1庚烷磺酸钠混合水溶液（pH 3.8）（B）、乙腈（A）-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾和0.05 mol·L-1庚烷磺酸钠混合水溶液（pH 3.1）（B）。结果流动相为乙腈-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液时，可待因出现双峰，罂粟碱峰宽较宽，而吗啡峰形正常；流动相为乙腈（A）-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾和0.05 mol·L-1庚烷磺酸钠混合水溶液（pH 3.8）（B），进行梯度洗脱时，可待因和罂粟碱峰分离度及峰形良好，而吗啡峰宽较宽（柱效不够高）；流动相为乙腈（A）-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾和0.05 mol·L-1庚烷磺酸钠混合水溶液（pH 3.1）（B）时，吗啡峰形良好，但可待因和罂粟碱的峰形及分离度不如pH=3.8时的好。故将吗啡与另外2个生物碱可待因、罂粟碱分别进行测定。
3.4 测定波长的选择参考文献[13-15]，吗啡和可待因大多选择检测波长为210 nm，本文发现吗啡和可待因在波长为220 nm处与210 nm处吸收度几乎相同，而溶剂甲醇在210 nm处也有吸收，为了避免甲醇的溶剂峰干扰影响，将吗啡、可待因的检测波长定为220 nm。罂粟碱最大吸收为257 nm，由于可待因与罂粟碱含量较低，为获得更大灵敏度，选择各自最大吸收波长处测定。
3.5 小结本法经方法学验证，可以对热感赛比斯坦颗粒的有毒药材罂粟壳和罂粟籽进行含量测定，从而保证该制剂的安全性。
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