2017, Vol. 37 
葫芦科（Cucurbitaceae）隶属于葫芦目（Cucurbitales）[1]，迄今为止，在地球上共发现约125个属，960个种[2]。葫芦科植物主要分布在热带及亚热带，在温带地区也有少数分布，它不仅具有观赏和食用价值，而且具有很好的药用价值。该科植物具有抗肿瘤、抗肝癌、抗胃癌、保肝及提高机体免疫力等多种生物活性，研究表明[3-6]，其主要活性成分是一种高度氧化的葫芦素型四环三萜类化合物，其中葫芦素B和葫芦素E分布最为广泛，关注度高。葫芦科植物甜瓜蒂、南瓜蒂、栝楼、雪胆和木鳖子分布广泛，均含有丰富的葫芦素型化合物[7]。
为消除病虫、微生物等危害，中草药入药前常常需要灭菌处理，目前常用的灭菌方法有湿热灭菌、微波灭菌和60Co-γ射线灭菌等多种方式，但中药成分大多不稳定，易受温度、湿度及压力等因素影响，导致药品质量下降，从而使药效降低。60Co-γ射线灭菌方法是20世纪兴起的一种灭菌及保鲜技术[8]，具有穿透力强，无损伤，经济实用等诸多优势[9]，近年来在中药领域得到广泛的应用[10-12]。
60Co-γ射线灭菌能有效消除中草药中微生物危害，同时此方法也存在较多安全隐患[13]，若使用不当，会降解或消除药材内在生物活性，降低药物医用价值。葫芦科植物具有很好药用价值，近年来相关研究较多，而对利用60Co-γ射线灭菌该类药物所造成生物活性的影响方面研究至今尚未见报道。
甜瓜蒂、南瓜蒂、栝楼、雪胆和木鳖子5种葫芦科植物受生长环境的影响较小，分布广泛，且葫芦素类含量丰富，有很高的药用价值。本实验拟采用60Co-γ射线对这5种葫芦科植物进行辐射灭菌处理，建立葫芦素B和E的含量测定方法，分别考察2、5、10 kGy 3种辐照剂量对葫芦素B和E含量的影响，并确定最佳有效辐照强度条件，为葫芦科植物实际生产灭菌提供参考依据。
1 仪器和材料Agilent 1260 infinity高效液相色谱仪（安捷伦公司）；Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；安捷伦公司）；辐照源为60Co-γ射线辐照设备（上海束能辐照技术有限公司）；Secura5102-1CN型电子天平（赛多利斯公司）；30 B型中草药粉碎机（常州市皖苏干燥设备有限公司）；P70H专家型超声波清洗器（Elma公司，总功率820 W）；Milli-QAcademic超纯水系统（默克密理博公司）。
对照品葫芦素B（批号111945-201301，含量96.9%，中国食品药品检定研究院），葫芦素E（批号MUST-11092803，含量≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
甜瓜蒂（T1）、南瓜蒂（T2）、栝楼（T3）、雪胆（T4）和木鳖子（T5）均购自安徽省亳州药材市场，经鉴定，甜瓜蒂为葫芦科植物甜瓜（Cucumis melo L.）的果柄，南瓜蒂为葫芦科植物南瓜（Cucurbita moschata Duch.）的瓜蒂，栝楼为葫芦科植物栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim.）的果实，雪胆为葫芦科植物雪胆（Hemsleya amabilis Diels）块茎，木鳖子为葫芦科植物木鳖子（Momordica cochinchinensis（Lour.）Spreng.）的种子。世界卫生组织规定辐射灭菌物品剂量不得超过10 kGy，本研究取T1~T5号药材分别以2、5、10 kGy剂量辐照处理。
2 方法与结果 2.1 灭菌效果检查分别取经辐照处理前后药材适量，粉碎，过筛（4号筛），称取细粉10 g，置250 mL锥形瓶中，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL，超声（250 W，40 kHz）使溶解完全，制成1:10的供试液，继续取上清液按10倍稀释法制得1:100和1:1 000的供试液。取上述制备好的供试液各l mL，置无菌平皿（直径90 mm）中，分别注入熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基（不超过45 ℃）15~20 mL，混匀，待凝固，置培养箱中按规定培养，检查辐射前后5种葫芦科药材需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。结果见表 1。
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表 1 辐照前后样品含菌量测定结果 Table 1 Results of bacteria level in samples before and after irradiation |
精密称取葫芦素B对照品18.26 mg和葫芦素E对照品13.55 mg，置同一100 mL量瓶中，加甲醇20 mL，超声（功率600 W，频率40 kHz）溶解30 min（冰浴），用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中分别含葫芦素B 0.183 mg和葫芦素E 0.136 mg的混合对照品溶液，滤过（0.22 μm微孔滤膜），取续滤液，即得。
2.2.2 供试品溶液分别取T1~T5号经不同辐射剂量处理的药材适量，粉碎过筛（4号筛），称取药材细粉2.0 g，精密称定，分别置250 mL具塞锥形瓶中，加甲醇100 mL，超声（功率600 W，频率40 kHz）溶解60 min（冰浴）后，浸渍过夜，取浸渍液适量，滤过（0.22 μm微孔滤膜），即得。
2.3 色谱条件色谱柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1 %冰醋酸水溶液（B），梯度洗脱（0~8 min，10%A→20%A；8~15 min，20%A；15~25 min，20%A→30%A）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：234 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。
取混合对照溶液及各供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，测定结果见图 1，色谱峰分离完全，杂质峰对主峰无干扰，葫芦素B和E峰理论板数均计大于3 000。
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1.葫芦素B（cucurbitacin B）2.葫芦素E（cucurbitacin E） 图 1 对照品（A）、甜瓜蒂（B）、南瓜蒂（C）、栝楼（D）、雪胆（E）及木鳖子（F）HPLC图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances (A), Pedicellus melo (B), Cucurbita moschata (C), Trichosanthes kirilowii (D), Hemsleya amabilis (E)and Momordica cochinchinensis(F) |
分别精密吸取混合对照品溶液3、6、12、18、36、48 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以化合物峰面积的积分值（Y）对进样质量（X）进行线性回归，求各组分线性范围及相关系数。以10倍稀释法将混合对照品溶液稀释制成系列浓度溶液，分别进行测定，记录色谱图，取峰面积信噪比为10（S/N=10）时浓度为定量限（LOQ）。结果见表 2。
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表 2 线性关系和定量限 Table 2 Linearity and LOQ |
取混合对照品溶液，按“2.3”项色谱条件连续进样5次，记录色谱图，测得葫芦素B和E峰面积的RSD（n=5）分别为0.12%和0.46%，表明仪器精密度良好。
2.4.3 重复性试验取T1~T5号供试品（0 kGy）各适量，粉碎，过筛（4号筛），分别按“2.2.2”项方法平行制备6份供试品溶液，按“2.3”项色谱条件进行分析，记录色谱图，以外标法计算组分含量。结果葫芦素B和E平均含量分别为8.180、6.373、3.951、4.591、2.284 mg·g-1和3.192、2.730、3.964、0.344、1.718 mg·g-1，RSD（n=6）均小于0.8%，表明方法重复性较好。
2.4.4 稳定性试验取T1~T5号药材的供试品溶液（0 kGy），分别于0、5、8、12、15、20、24 h按“2.3”项色谱条件测定，记录色谱图。结果葫芦素B和E峰面积的RSD（n=5）均小于1.1%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.4.5 加样回收率试验取T1~T5号药材的供试品（0 kGy）各6份，粉碎，过筛（4号筛），精密称取药材细粉1.0 g，置250 mL具塞锥形瓶中，分别加入葫芦素B和E的对照品各适量，按“2.2.2”项方法制备供试溶液，在“2.3”项色谱条件下进行测定，记录色谱图，计算回收率，结果见表 3，表明加样回收率较好，符合含量测定要求。
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表 3 加样回收试验结果（n=6） Table 3 Results of Recovery test |
取T1~T5号药材样品在不同辐射剂量下处理的药材供试品各适量，分别按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，每种药材平行制备3份溶液，按“2.3”项色谱条件进行测定，记录色谱图，按外标法计算各组分含量，结果见表 4。经配对t检验，辐照前与辐照后（2、5和10 kGy）葫芦素E的含量差异无统计学意义（p＞0.05）；在2、5 kGy剂量下辐照时，辐照前后无统计学意义（p＞0.05），而当剂量增加到10 kGy时，葫芦素B的含量存在显著性差异（p＜0.05）。可以看出，60Co-γ射线灭菌法对葫芦素B含量有一定影响，经5、10 kGy辐照后，甜瓜蒂、南瓜蒂、栝楼、雪胆和木鳖子中葫芦素E含量分别降低14.67%、65.08%、35.16%、30.40%和43.52%；而对葫芦素E含量影响不大。
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表 4 样品的测定结果（mg·g-1，n=3） Table 4 The determination results of the samples |
葫芦科植物在大自然中分布很广泛，甜瓜蒂、南瓜蒂、栝楼、雪胆和木鳖子是几种常见葫芦科植物，它们都含有葫芦素型四环三萜类活性成分，在体内外均具有较强抗癌、抗肿瘤、保肝、抗炎、提高机体免疫力等生物活性[14]，尤其在抗癌方面的应用已成为研究的热点。葫芦素B具有α、β酮醇结构，在加热或光照情况下有自动氧化的倾向，而葫芦素E性质较稳定[15]。化学结构式见图 2。
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图 2 葫芦素B（A）和E（B）化学结构图 Figure 2 Structures of cucurbitacins B (A)and E(B) |
葫芦素B结构不稳定性也进一步验证了实验结果，在60Co-γ射线辐照下，5种葫芦科植物中葫芦素B含量都有一定程度下降。所以为了保证药品质量，葫芦科药材应在凉暗处保存。
3.2 辐照剂量的选择从表 1可以看出，60Co-γ射线辐照可以杀死药材中绝大多数微生物，起到很好的灭菌作用，但过大剂量会降低葫芦素B含量，所有辐照剂量的选择十分关键。
实验过程中，同时取5种葫芦科药材，分别以剂量0、2、5、10 kGy辐照处理后，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项色谱条件进行测定，分别计算葫芦素B和E的含量，并绘制含量随剂量变化折线图，结果见图 3。
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A.葫芦素B（cucurbitacin B）B.葫芦素E（cucurbitacin E） 图 3 不同剂量60Co辐照对葫芦科植物中有效成分的影响 Figure 3 Contents of active ingredients in cucurbitaceous plants irradiated at different doses |
从图 3可以看出，葫芦素E折线基本为一条直线，辐照灭菌对其含量影响不明显；葫芦素B折线则在5 kGy处出现明显向下趋势，表示当剂量增加到5 kGy以上时，葫芦素B含量呈下降趋势，这也与“2.5”项下对含量数据进行的成组配对t-检验结果一致，为防止有效成分降解，影响药品质量，故建议60Co-γ射线辐照不宜高于5 kGy。
本实验采用HPLC法考察60Co-γ射线辐照对甜瓜蒂、南瓜蒂、栝楼、雪胆和木鳖子5种葫芦科植物四环三萜类有效成分的影响，发现辐照剂量控制在5 kGy时，能有效对药材消毒灭菌，同时不影响药材质量，可为今后该类药物采用60Co-γ射线辐照灭菌提供参考。
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