阿仑膦酸钠(alendronate sodium，结构见图 1)是第3代氨基二膦酸盐类骨吸收抑制剂，其化学名为[4-氨基-1-羟基亚丁基]二膦酸钠。与前2代二膦酸盐类药物相比，阿仑膦酸钠的抗骨吸收性强，且没有骨矿化抑制作用，是恶性肿瘤及佩吉特骨病引起的高钙血症的一线治疗药物。然而，阿仑膦酸钠口服生物利用度极低，据报道，人口服后绝对生物利用度低于1.0%^[1]，因此体内血药浓度极低，常通过测定尿液中药物的累积排泄量来评价其生物利用度^[2]。为此，建立简便、稳定的阿仑膦酸钠尿液检测方法是阿仑膦酸钠制剂改进及生物利用度评价的前提和基础。

HPLC-UV方法稳定性好，灵敏度能满足一般体内药物分析要求，但由于阿仑膦酸钠结构中没有生色团，无法利用UV检测器直接进行检测。在过去十几年中，文献报道了几种HPLC柱前衍生化^[2-4]或柱后衍生化^[5]检测阿仑膦酸钠的方法。异硫氰酸苯酯(PITC)是一种比较理想的氨基酸及小肽类药物的衍生化试剂^[6]，PITC比邻苯二甲醛(OPA)稳定，能应用于仲胺和亚氨基酸的检测，且衍生化产物不易受空气、光照的影响。

至今未见以PITC为衍生化试剂生成阿仑膦酸钠-PITC酰胺化产物用于体内外检测阿仑膦酸钠的报道，因此，本文以PITC为衍生化试剂，建立了样品预处理简单及重复性好的对大鼠尿液中阿仑膦酸钠定量测定的HPLC-UV分析方法。以此为基础，获得了大鼠口服阿仑膦酸钠后的尿液排泄动力学参数，为阿仑膦酸钠口服制剂吸收生物利用度研究和评价提供了新的体内药物检测方法。

1 仪器与试药 1.1 仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪(由四元梯度泵、脱气单元、UV-可见光检测器、柱温箱、自动进样器、化学工作站构成，Agilent公司)；Venusil AA分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：改性十八烷基硅烷键合硅胶；天津博纳艾杰尔科技有限公司)；电子分析天平(上海卓精电子科技有限公司)；高速离心机(TGL-16G，上海安亭科学仪器)；精密数显酸度计(PHS-2TC，0.01级，上海之信仪器有限公司)；BONDELUT-DEA固相萃取小柱(100 mg，1 mL，100/PK，Varian公司)；DAS 2.1.1统计软件(上海中医药大学药物临床研究中心)。

1.2 试药

阿仑膦酸钠对照品(纯度大于97%；阿拉丁试剂有限公司)；正亮氨酸内标物(纯度大于99%；成都艾科达化学试剂有限公司)；异硫氰酸酯(PITC，成都艾科达化学试剂有限公司)；三乙胺(安捷伦试剂有限公司)；甲酸(色谱纯；阿拉丁试剂有限公司)；无水醋酸钠(纯度大于99%；天津大茂试剂有限公司)；正己烷(分析纯；天津大茂试剂有限公司)。甲醇、乙腈均为色谱纯。

2 方法 2.1 色谱条件

色谱柱：Venusil AA分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A相为0.095 mol·L^-1乙酸钠乙腈溶液(pH 6.5)，B相为80%乙腈，梯度洗脱(0~10 min，100%A；10~15 min，线性梯度100%A→90%A；15~25 min，线性梯度90%A→70%A；25~33 min，线性梯度70%A→55%A；33~38 min，恒梯度0%A；38~45 min，100%A)，流速为0.8 mL·min^-1，柱温40 ℃，检测波长270 nm，进样量10 μL。

2.2 样品前处理所需溶液的配制

用蒸馏水配制阿仑膦酸钠储备液，质量浓度为500.0 μg·mL^-1；用乙腈配制三乙胺-乙腈溶液(14：86，v/v)；用乙腈配制PITC-乙腈溶液(1：80，v/v)；用0.1 mol·L^-1盐酸配制1 mg·mL^-1正亮氨酸内标溶液。

2.3 样品前处理及衍生化步骤

大鼠尿液样品自然解冻后，取尿液0.8 mL，加入甲醇3.2 mL以沉淀蛋白质，漩涡振荡2 min，于8 000 r·min^-1离心5 min，取上清，真空离心烘干后，用200.0 μL蒸馏水复溶。过预先用水活化后的固相萃取小柱，弃去滤液；再用5%甲醇1.0 mL洗脱，弃去滤液；然后再用40%甲醇1.0 mL洗脱，收集滤液，烘干，用200.0 μL水复溶，往离心管中分别准确加入1 mg·mL^-1正亮氨酸内标溶液20.0 μL，三乙胺-乙腈溶液(14：86，v/v)100.0 μL，PITC-乙腈溶液(1：80，v/v)100.0 μL，涡旋混匀，静置1 h，然后加入正己烷800.0 μL，振摇后放置10 min，取下层溶液，用0.45 μm滤膜过滤，进样10.0 μL。

2.4 工作曲线的制备

精密移取未给药大鼠尿液0.8 mL，加入甲醇3.2 mL，沉淀蛋白，涡旋振荡2 min，8 000 r·min^-1离心5 min，取上清，烘干后以100.0 μL水复溶，再加入不同浓度的阿仑膦酸钠溶液100.0 μL，制成阿仑膦酸钠终浓度为2.5、5.0、10.0、12.5、25.0、50.0、100.0、125.0和250.0 μg·mL^-1的标准阿仑膦酸钠溶液。取系列阿仑膦酸钠溶液200 μL，分别按“2.3”项下方法自“分别准确加入1 mg·mL^-1正亮氨酸内标溶液20.0 μL”起操作，衍生化后分别进样进行色谱分析，以阿仑膦酸钠浓度X(μg·mL^-1)为横坐标，阿仑膦酸钠与内标物的峰面积比值Y(A_S/A_i)为纵坐标，用加权最小二乘法(权重系数：1/X²)进行线性回归。

2.5 大鼠口服阿仑膦酸钠溶液尿液收集及处理

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠8只(购自南昌大学医学院动科部)，体重(200±20) g，不锈钢代谢笼单独饲养，每天光照12 h，室温(22~24 ℃)，室内相对湿度30%~70%。在给药前禁食12 h，正常饮水，收集尿液作空白尿；上述收集尿样马上于5 000 r·min^-1离心10 min，-20 ℃冷冻保存。实验日早晨灌胃1.0 mL阿仑膦酸钠溶液(0.90 mg·mL^-1)。尿液样品收集时间分别为给药后第2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、24.0、36.0、48.0、60.0 h，尿液收集后立即5 000 r·min^-1离心5 min，取上清，记录实际体积置于-20 ℃冰箱备用。

3 结果 3.1 衍生化试剂量对产物阿仑膦酸钠-PITC含量的影响

按“2.3”项所述衍生化步骤，本实验选取了不同量的PITC-乙腈溶液(1：80，v/v)25、50、75、100、125、150、200 μL等考察衍生化试剂PITC量对衍生化反应产物的影响。结果显示随着PITC量的增加，阿仑膦酸钠-PITC含量增加，但PITC量超过100 μL后，衍生化产物反而随着剂量的增加而减少(见图 2)，其原因可能是过量的PITC无法被正己烷完全萃取进入上层有机相，致使下层水相体积加大，导致被检测的衍生化产物浓度降低。所以本实验采用100 μL的PITC作为衍生化试剂，此条件下阿仑膦酸钠和PITC可以充分衍生化。

3.2 方法专属性

取阿仑膦酸钠对照品、不同个体(考察6个以上)空白尿液样品以及给药后0~2 h尿液样品，按“2.3”项前处理及衍生化后进样测定，典型色谱图如图 3所示。从图中可以看出，阿仑膦酸钠和IS两者的保留时间分别为9.89 min和31.5 min，两者与尿液中的内源性物质(主要是氨基酸)达到基线分离。说明该方法具有良好的专属性。

3.3 工作曲线的建立

按照“2.4”项方法操作，阿仑膦酸钠质量浓度在2.5~250.0 μg·mL^-1范围，得回归方程：

$ \mathit{Y}\rm{=0}\rm{.073}\ \rm{16+0}\rm{.001}\ \rm{95}\mathit{X}\ \ \ \mathit{r}\rm{=0}\rm{.999} $

表明阿仑膦酸钠浓度和色谱峰面积信号具有良好的相关性，满足定量的要求。逐步稀释标准阿仑膦酸钠溶液，进样测定；根据色谱信号信噪比等于3：1为检测限和10：1为定量限，测得阿仑膦酸钠的检测限为0.2 μg·mL^-1，定量限为0.5 μg·mL^-1。

3.4 精密度试验

空白尿样加终浓度为5.0、50.0、150.0 μg·mL^-1的阿仑膦酸钠对照品溶液，每个浓度平行5份标准样品，按“2.3”项步骤处理衍生化后，在同一天(及第2天)连续进样6次，计算相关色谱峰的峰面积，计算标准偏差表示日内、日间精密度。结果显示3个浓度的阿仑膦酸钠的日内精密度和日间精密度均小于3.0%。

3.5 样品稳定性试验

上述50.0 μg·mL^-1标准样品置于室温条件下(25±2)℃，经衍生化后，考察样品在室温条件下放置24 h、3 d、7 d的稳定性。测定结果显示阿仑膦酸钠在24 h内峰面积RSD＜5.0%，表明实验样品衍生化后24 h稳定性良好。

3.6 回收率试验

取大鼠空白尿液100 μL，加入不同浓度的阿仑膦酸钠对照品溶液100 μL，至终浓度为5、150、250 μg·mL^-1，每个浓度平行5份，按“2.3”项下方法衍生化后进样测定峰面积A₁，计算实测浓度，以实测浓度与理论浓度比较，测得方法回收率；另用蒸馏水配制质量浓度为5、150、250 μg·mL^-1的阿仑膦酸钠溶液各5份，按“2.3”项下方法衍生化后进样测定峰面积A₂，以A₁与A₂比较，得到提取回收率，结果见表 1。

3.7 口服阿仑膦酸钠溶液尿液排泄动力学

取按“2.5”项下方法收集的尿液，按“2.3”项下方法操作。以单位时间药物排泄量做对数变换后(LogΔu/Δt)与时间作图(图 4)，对消除相线性回归，求得直线斜率K，以T_1/2=0.693/K计算阿仑膦酸钠在体内的消除半衰期，相应的尿液排泄动力学参数列于表 2。尿液36 h累积阿仑膦酸钠为(42.6±1.2)μg。

4 讨论

阿仑膦酸钠的体内外基于HPLC技术的检测方法主要是采用阿仑膦酸钠柱前衍生化或柱后衍生化方法生成阿仑膦酸钠衍生物，以达到阿仑膦酸钠能在反相色谱柱上保留及利用紫外、荧光检测器能检测的目的。如Kline等^[2]以2，3-二羟基萘(NDA)为衍生化试剂，采用HPLC-电化学检测法和HPLC-荧光检测法测人尿液中的阿仑膦酸钠；Flesch等^[3-4]以荧光胺为衍生化试剂，用HPLC-荧光检测器检测人血液和尿液中的阿仑膦酸钠；Lovdahl等^[5]使用柱后间接荧光检测测定双膦酸盐类。

由于氨基不具有紫外和荧光吸收特性，采用HPLC进行检测时需对氨基基团进行柱前或柱后衍生。常用的衍生试剂主要有OPA^[7]、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)^[8-11]、4-二甲胺基偶氮苯-4′-磺酰氯(DABS-Cl)^[12]、PITC^[13-14]等。OPA是应用最广泛的伯胺类药物的荧光标记试剂，它本身没有荧光性，但其衍生物有很强的荧光性。聂小春等^[15]用OPA和2-巯基乙醇(2ME)作为衍生化试剂，运用柱前衍生化方法对阿仑膦酸钠与4-氨基丁酸(GABA)的含量进行同时测定。张露蓉等^[16]采用DABS-Cl柱前衍生(RP-HPLC)法定量测定血清中18种游离氨基酸。FMOC-Cl常用作伯胺类药物的紫外衍生化试剂，萘-2-磺酰氯和N，N-二乙基-2，4-二硝基-5-氟苯胺是优良的伯胺及仲胺的衍生化试剂。PITC是一种比较理想的氨基酸及小肽类药物的衍生化试剂，PITC与阿仑膦酸钠反应，反应产物在原来的阿仑膦酸钠结构上引入苯环，可以大大地降低阿仑膦酸钠的极性和增加生色基团，且衍生后的产物不易受空气、光照的影响，化学性质稳定，因此本实验采用PITC为衍生化试剂，用反相HPLC-UV法测定大鼠尿液中的阿仑膦酸钠。

色谱分离条件的优化方面，本实验主要考察固定相、温度和荧光和紫外检测器等因素对样品分离效果的影响。考察用不同分析柱Venusil AA分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和依利特ODS柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)]对阿仑膦酸钠进行检测，结果显示阿仑膦酸钠在Venusil AA分析柱能得到良好的分离。同时考察了3个不同柱温(25、30、40 ℃)对阿仑膦酸钠检测的影响，结果显示在40 ℃条件下，色谱峰形对称，检测效果比25 ℃和30 ℃的检测效果好。本实验还比较了荧光检测器(激发波长262 nm和发射波长425 nm)及UV检测器不同检测波长(254、265、270 nm)下对尿液中阿仑膦酸钠检测结果的影响。结果显示，2种检测器对阿仑膦酸钠的检测灵敏度相近；相对于荧光检测器，紫外检测器基线更为平稳，且检测波长为270 nm时内源性干扰物质的吸收最小，因此本实验选用270 nm作为阿仑膦酸钠的检测波长。结果显示该分析方法最低检出限低为0.2 μg·mL^-1，且在2.5~250 μg·mL^-1的范围内线性良好。

大鼠单次口服给予阿仑膦酸钠溶液(4.5 mg·kg^-1)后，从时间-单位时间阿仑膦酸钠排泄量图(图 4)，可以看出，阿仑膦酸钠给药后在大鼠体内吸收较快，2 h左右出现最大排泄峰，随后尿液中阿仑膦酸钠浓度下降。阿仑膦酸钠在体内消除较快，半衰期为(4.5±0.12) h，36 h尿液累积排泄量为(42.6±1.2)μg，占给药剂量的4.7%，比文献报道^[17-18]高，可能与本实验使用溶液剂和低剂量有关。由于阿仑膦酸钠具有很强的极性，难以穿过细胞膜，因此口服给药后体内血药浓度极低，通常通过测定尿液中药物的累积排泄量来评价其制剂的生物利用度^[2]。本文以PITC为衍生化试剂，建立了重复性好的大鼠尿液中阿仑膦酸钠定量分析HPLC-UV方法。实验结果表明，该方法专属性强，在一定的浓度范围内具有良好的线性关系，良好的精密度及较高的准确度，可用于阿仑膦酸钠的尿液排泄动力学研究。