阿卡波糖(结构式见图 1-a)是一种从放线菌中分离得到的由4个单糖构成的寡糖，对小肠壁细胞刷状缘的α-葡萄糖苷酶具有竞争性抑制作用^[1]，能阻碍肠道内的多糖和低聚糖的水解，从而减少小肠对单糖的吸收，达到降低餐后血糖浓度的目的，是Ⅱ型糖尿病的常用药物之一。该药物作用机制独特，降糖疗效平稳，副作用小，且能够显著降低心血管事件的发生，市场前景十分广阔。

目前，阿卡波糖含量及其杂质测定的方法为高效液相色谱法，采用氨基色谱柱，35 ℃柱温，以乙腈-磷酸盐缓冲液(75：25) 为流动相，流速2 mL·min^-1，检测波长210 nm，样品检测时间达40 min左右。虽然该法已经收载到了欧洲药典(8.0版)^[2]和中国药典(2015年版)^[3]，但该方法存在的以下几种缺点严重影响了方法的重现，并造成应用困难：一是氨基色谱柱使用寿命短，使用150次左右柱效严重降低，色谱峰拖尾，不能继续使用^[4]；二是杂质A(O-4，6-双脱氧-4 -[[(1S，4R，5S，6S)-4，5，6-三羟基-3-(羟甲基)-2-环己烯]氨基]-α-(1→4)-O-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-D-葡萄糖烯-2-吡喃酮糖)，发酵及降解过程中的主要杂质(结构见图 1-b)与阿卡波糖的色谱行为相似，不能完全分离^[5](欧洲药典以峰谷比不小于1.2为准)；三是流动相中乙腈比例大，流速快，但检测时间长，导致检测成本高。目前国内外关于阿卡波糖的研究^[4-8]，并未很好地解决阿卡波糖及其有关物质分离效果差，杂质干扰大及柱流失严重等问题。因此，有必要开发一种阿卡波糖含量及其杂质测定的新方法，以改善方法的重现性和可应用性，提高药品质量控制水平。

1990年，Alpert提出了亲水作用色谱(hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)的概念^[9]。在HILIC模式下，流动相通常为水和有机溶剂(主要为乙腈，含量＞60%)，固定相为亲水的极性材料。HILIC的固定相多种多样，除了传统的未衍生化硅胶和氨丙基键合硅胶外，还有氰基、二醇基、酰胺型、聚琥珀酰亚胺型、糖型和两性离子型键合硅胶^[10]。HILIC的保留机理非常复杂，有关HILIC对溶质的保留机理尚无定论。Alpert^[11]提出了主要由亲水作用产生的分配机理：在HILIC的模式下，当流动相进入色谱柱时，固定相表面会选择性吸附流动相中的水，在表面形成动态的“富水层”，溶质通过在“富水层”与流动相中的分配作用(主要作用)，同时还存在偶极-偶极相互作用、氢键作用、离子交换作用，从而实现保留，这种观点得到很多人的支持。

HILIC适合分离强极性和亲水性样品，是寡糖分离的理想色谱模式^[12-13]。氨基键合相是最早用于HILIC的极性键合固定相，该类色谱柱是经典的糖类分析柱。但氨基容易与还原性的糖形成Schiff碱，改变键合相和分析物的性质，同时氨基的柱稳定性较差，键合相容易流失^[14]。本文选用XBridge Amide色谱柱，该柱使用了化学稳定的、三键键合式的酰胺官能团，其选择性与氨基柱相近，且基于BEH(亚乙基桥杂化颗粒)技术，色谱柱耐受性更强(pH 2~11)，极端pH条件下最高柱温可达90 ℃，相对于氨基键合相的稳定性更高(柱流失减少)，寿命更长^[15]。Mark等^[16]利用XBridge Amide色谱柱无需衍生成功分离了糖蛋白水解的单糖。利用示差折光或蒸发光检测器，XBridge Amide色谱柱可同时分离测定无紫外吸收的单糖和低聚糖^[17-18]。与此同时，XBridge Amide色谱柱在核苷^[19]、多羟基生物碱^[20]、氨基酸以及多肽^[21]等极性物质中都有广泛应用。

在本研究中，将酰胺键合相色谱柱应用于阿卡波糖分析，并通过正交设计试验对色谱参数中的流动相pH、盐浓度、柱温及流速进行了考察分析，建立了一种柱稳定性更高，阿卡波糖与有关物质分离效果更好的HPLC测定方法，成功解决了现有方法中存在的分离效果差，杂质干扰大及柱流失严重等问题，为阿卡波糖及其杂质的研究提供了一种新的方法。

1 仪器与试药

岛津公司LC-20A高效液相色谱仪系统(包括LC-20AT泵；DGU-20A脱气机；SIL-20A自动进样器；CTO-10ASvp柱温箱；SPD-20A紫外检测器；Lab solution色谱工作站)；Waters公司XBridge Amide色谱柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm；填料：三键键合式酰胺键合硅胶)；Ohaus Corp.Brook公司AR1140万分之一电子天平；Mettler Toledo公司MS105Du型十万分之一电子天平；上海精科实业有限公司pH Meter PHS-3C电子pH计；无锡建仪实验器材有限公司SK250HP超声波清洗器。

阿卡波糖对照品(批号100808-201203，含量95.8%，中国食品药品检定研究院)；阿卡波糖峰鉴别对照品[添加了杂质A，B，C，D，E，F和G的阿卡波糖对照品，每瓶20 mg，欧洲药品质量管理局(EDQM)]；杂质A对照品(每瓶1 mg，TRC-Canada公司)；阿卡波糖胶囊(批号140305、140308、140314，四川绿叶宝光药业股份有限公司)；乙腈为色谱纯，甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙酸和氨水为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果 2.1 溶液的配制 2.1.1 备用缓冲盐溶液及流动相

200 mmol·L^-1甲酸铵缓冲盐溶液(pH 3.0)：称取甲酸铵12.6 g至1 L量瓶中，加适量水溶解，加入甲酸25 mL，混匀，加水定容至刻度，即得；200 mmol·L^-1乙酸铵缓冲盐溶液(pH 6.8)：称取乙酸铵15.4 g至1 L量瓶中，加水溶解定容，即得；200 mmol·L^-1乙酸铵缓冲盐溶液(pH 9.0)：称取乙酸铵15.4 g至1 L量瓶中，加适量水溶解，加入氨水8 mL，混匀，加水定容至刻度即得。

流动相：由相应的备用缓冲盐溶液，经75%乙腈水按比例稀释而得：在750 mL乙腈和200 mL水中加入200 mmol·L^-1乙酸铵缓冲盐溶液(pH 9.0)50 mL，混匀，超声(功率200 W，频率59 kHz)，即得10 mmol·L^-1乙酸铵缓冲盐水溶液(pH 9.0)-乙腈(25：75) 的流动相。同法，在750 mL乙腈和200 mL水中加入200 mmol·L^-1甲酸铵缓冲盐溶液(pH 3.0)50 mL或200 mmol·L^-1乙酸铵缓冲盐溶液(pH 6.8)50 mL，即得10 mmol·L^-1甲酸铵缓冲盐水溶液(pH 3.0)-乙腈(25：75) 或10 mmol·L^-1乙酸铵缓冲盐水溶液(pH 6.8)-乙腈(25：75) 的流动相。

2.1.2 阿卡波糖峰鉴别对照品溶液

取阿卡波糖峰鉴别对照品1瓶(20 mg)，加1 mL流动相溶解，摇匀，即得。

2.1.3 阿卡波糖对照品溶液

称取阿卡波糖对照品适量，精密称定，加流动相制成质量浓度为1 mg·mL^-1的溶液，摇匀，即得。

2.1.4 杂质A对照品溶液

取杂质A对照品1瓶(1 mg)，加1 mL流动相溶解，摇匀，即得。

2.1.5 杂质A与阿卡波糖对照品混合液

取杂质A对照品溶液100 μL与阿卡波糖对照品溶液900 μL，混匀，即得。

2.1.6 阿卡波糖供试品溶液

称取阿卡波糖胶囊内容物适量，精密称定，约相当于阿卡波糖25 mg，置于25 mL量瓶中，加流动相适量超声(功率200 W，频率59 kHz)溶解，加流动相定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2 色谱条件

采用Waters XBridge Amide色谱柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)，以10 mmol·L^-1乙酸铵缓冲盐水溶液(pH 9.0)-乙腈(25：75) 为流动相，流速1.2 mL·min^-1，柱温65 ℃，检测波长210 nm，进样量20 μL。

2.3 正交设计试验 2.3.1 正交试验因素水平的选取与实验设计

通过前期实验的摸索，综合考虑阿卡波糖的保留时间及其杂质的分离情况，流动相中10 mmol·L^-1乙酸铵缓冲盐水溶液(pH 9.0)-乙腈的比例确定为25：75。为确立最终色谱条件，采用4因素3水平正交设计(L₉(3⁴)正交表，见表 1)，对以下4因素进行考察：

因素A：流动相的pH。考察酸性、中性和碱性条件对阿卡波糖峰形及保留的影响，故设定以下pH水平：3.0、6.8、9.0。

因素B：柱温。预实验中35 ℃条件下阿卡波糖存在双峰现象，据文献[13]所述，糖类α，β异构体间的转化率随温度而变，提高温度可使分裂峰合并为单峰。故考察柱温的水平：45、55、65 ℃。

因素C：流动相中的盐浓度。为得到良好的峰形和保留作用，在流动相中添加缓冲盐，结合所用色谱柱，优选乙酸铵。考察盐浓度水平：5、10、20 mmol·L^-1。

因素D：流速。流速不仅影响着保留时间，也与化合物间的分离情况有关。设定以下流速水平：1.0、1.2、1.4 mL·min^-1。

每个试验条件下进样顺序：(1) 空白(流动相)；(2) 杂质A与阿卡波糖对照品混合液；(3) 阿卡波糖峰鉴别标准品溶液。

组配了3个指标做优劣判断：① 可分离的杂质个数(N)；② 阿卡波糖色谱峰的拖尾因子(T)；③ 杂质A与主峰的分离度(R)。

2.3.2 正交试验结果分析

正交试验方案设计及结果如表 2所示。

对于多指标正交试验结果数据的分析，常用的方法有“综合评分法”和“综合平衡法”。根据文献[22]所述，只要评价试验指标的原则不变，不会因为使用不同的分析方法而改变较优方案的选择，特别是对于主要因素的水平选择，故本文中选择综合平衡法进行分析。综合平衡法是对所测得的各项指标，先分别按单指标极差分析，找出其因素水平的最优组合，然后根据各项指标重要性及各项指标中所得出的因素主次、水平优劣等进行综合平衡，最后确定整体最优因素水平组合。按照主峰拖尾因子越接近1.0越好、杂质个数越多越好、杂质A与主峰分离度越大越好的原则，对它们分别按单指标进行极差分析，计算结果见表 3。

对于不同指标而言，因素主次、水平优劣差异较大，确定整体最优因素水平，有一定难度，因此本试验综合各指标的优方案筛选出可能的整体较优组合，通过再次试验，确定最优组合。其中因素A选定水平3；因素B可选水平2或3；因素C在3项指标中影响均较小，选定水平2；因素D可选水平1或2。故综合平衡因素水平初步确定的较优组合为A₃B₃C₂D₁、A₃B₂C₂D₁、A₃B₃C₂D₂或A₃B₂C₂D₂。

为了确定最优组合，对4种可能的组合进行再次试验，结果见表 4。4种条件下，主峰均有良好的对称性，从杂质A与主峰分离度来看，A₃B₃C₂D₁、A₃B₃C₂D₂优于A₃B₂C₂D₁、A₃B₂C₂D₂，而A₃B₃C₂D₂的保留时间(结果未列出)要比A₃B₃C₂D₁的更短一些，所以选定的最优组合为A₃B₃C₂D₂。故最终确定的色谱条件参数：流动相pH 9.0，柱温65 ℃，盐浓度为10 mmol·L^-1，流速1.2 mL·min^-1。

2.4 阿卡波糖及其杂质在XBridge Amide色谱柱上的分离情况

在优化选择的色谱条件下，阿卡波糖与杂质A在XBridge Amide色谱柱上可完全分离(图 2)，分离度为2.175，阿卡波糖的保留时间约为19.1 min，杂质A的相对主峰的保留时间约为0.9。图 3为在本文色谱条件下得到的阿卡波糖峰鉴别对照品色谱图，与欧洲药品质量管理局提供的色谱图(图 4)比较可知，采用本法测定，在杂质A与主峰间可多检测出一种未知杂质。通过杂质A的相对保留时间定位，可知图 3中的4号峰为杂质A峰，其他杂质出峰顺序与图 4类似，推测峰2、3、6、7、8、9分别为杂质D、B、C、E、F、G，因未获得相关杂质对照品，故未做实验验证。综上所述，该方法不仅进一步改善了阿卡波糖与各杂质的分离情况，尤其是与杂质A的分离，还可多分离出1种未知杂质。

2.5 方法学验证 2.5.1 系统适用性试验

精密吸取阿卡波糖峰鉴别对照品溶液，按“2.2”项下条件进样分析，结果见图 3。理论塔板数以阿卡波糖峰计算不小于5 000，阿卡波糖峰与杂质A峰分离度大于1.5，其他杂质分离情况良好，主峰对称性良好。

2.5.2 线性关系考察

精密称取阿卡波糖对照品适量，加流动相溶解，制成4 mg·mL^-1的阿卡波糖对照品储备液。精密量取储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加流动相制成不同浓度的系列对照品溶液。按上述色谱条件分别进样分析，记录色谱图。结果表明阿卡波糖质量浓度(C)在0.2~1.2 mg·mL^-1范围内，与色谱峰面积(A)呈良好的线性关系，回归方程：

$ \mathit{A}\rm{=3}\rm{.00}\times \rm{1}{{\rm{0}}^{\rm{6}}}\mathit{C}\rm{-4}\rm{.02}\times \rm{1}{{\rm{0}}^{\rm{3}}}\ \ \ \mathit{r}\rm{=0}\rm{.999}\ \rm{8} $

2.5.3 检测限测定

将“2.5.2”项下浓度最低点的阿卡波糖对照品溶液逐级稀释，依次进样测定。以信噪比(S/N=3) 测定阿卡波糖检测限为0.08 μg。

2.5.4 精密度试验

取“2.5.2”项下的阿卡波糖对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，进行精密度试验。计算阿卡波糖峰面积的RSD(n=6) 为0.15%，结果表明仪器的精密度均良好。

2.5.5 重复性试验

取同一批胶囊样品(批号140314)，按“2.1.6”项下方法配制供试品溶液6份，按上述色谱条件进样，进行重复性试验。结果阿卡波糖含量平均值(n=6) 为98.60%，RSD为0.98%，表明重复性良好。

2.5.6 溶液稳定性试验

精密量取阿卡波糖供试品溶液，室温下放置，分别于0、2、4、6、8、10、24 h进样测定，结果阿卡波糖峰面积的RSD为0.29%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。

2.5.7 色谱柱稳定性

采用XBridge Amide色谱柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)，在进样第1、100、200及300针后，色谱峰的拖尾因子(T)、杂质A与主峰分离度(R)和主峰理论塔板数(n)见表 5，表明虽然本实验色谱条件使用了缓冲盐体系，以及较高的流动相pH和柱温，但该色谱柱依然展示了良好的柱稳定性。

2.5.8 加样回收率试验

取“2.1.6”项下已测知阿卡波糖准确含量的胶囊样品(批号140314)9份，再分别精密加入相当于阿卡波糖含量80%、100%、120%的对照品溶液，分别制备得到低、中、高3个浓度的供试溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表 6。

2.5.9 耐用性试验

为了研究液相色谱条件的微小变化对实验结果的影响程度，进行耐用性试验。考察因素有流动相的比例、pH及柱温、流速。将阿卡波糖供试品溶液与对照品溶液，分别在不同条件下注入液相色谱仪，按外标法计算阿卡波糖为标示量的百分百含量，结果见表 7。

2.6 含量测定

取3个批次阿卡波糖胶囊，按“2.1.6”与“2.1.3”项下方法制备供试品溶液与对照品溶液，进样分析，记录色谱图。按外标法计算阿卡波糖含量，结果见表 8。

3 结论

本文利用HILIC，采用XBridge Amide色谱柱，并借助正交试验对色谱参数中的流动相pH、盐浓度以及柱温和流速进行了考察分析，建立了一种阿卡波糖及其杂质分离研究的新方法，并通过了方法学验证。结果证明该法可将阿卡波糖与杂质A完全分离，而且XBridge Amide色谱柱采用了BEH(亚乙基桥杂化颗粒)技术，填料为酰胺三键键合相，与氨基柱相比固定相更稳定，不易产生柱流失，进样300多针，依然保持良好的峰形，较高的分离度及理论塔板数。

综上所述，本文建立的方法重复性好，结果准确，选用的色谱柱耐用性强，克服了阿卡波糖与相关杂质难分离的难题，解决了现有方法中存在的分离效果差、杂质干扰大及柱流失严重等问题，为阿卡波糖及其杂质的研究提供了一种全新的方法。