2017, Vol. 37 
2. 四川省食品药品检验检测院, 成都 610097
2. Sichuan Institute for Food and Drug Control, Chengdu 610097, China
蒲黄为香蒲科植物水烛香蒲Typha angustifolia L.、东方香蒲Typha orientalis Presl或同属植物的干燥花粉，收载于中国药典2015年版一部，具有止血、化瘀、通淋的功效，用于吐血、衄血、咯血、崩漏、外伤出血、经闭痛经、胸腹刺痛、跌扑肿痛、血淋涩痛[1]，为重要的中药品种。本文对国家评价性抽样中发现的可疑样品进行了检测，确证除已见报道并建立了标准的金胺O染色外[2]，蒲黄中还存在用柠檬黄及酸性黄36染色的情况，故建立了蒲黄中同时检查这2种染色剂的定性检验方法[3]。
酸性黄36（metanil yellow），又称酸性间胺黄、皂黄，为一种工业上应用的偶氮染料。工业上主要用于肥皂的着色和羊毛、丝绸织物的染色以及皮革、漆类及木制品着色、生物着色等。酸性黄36具有中等毒性，成人误服约0.25 g可引起中毒。在国家强制性标准中未规定其可作为食用色素使用，食品领域文献报道多用HPLC-DAD或HPLC-MS方法进行检测[4-7]。在中药材中尚未发现使用酸性黄36进行染色的报道。
柠檬黄（tartrazine），又称酒石黄、酸性淡黄、肼黄。为水溶性合成色素。柠檬黄不是蒲黄应有的化学成分，在药学领域主要用于胶囊壳的着色剂[8]。柠檬黄用于药材染色已有报道[9]，采用的是TLC初筛，HPLC确认的检测方法，但针对蒲黄药材尚无相关标准。
2种色素相对分子质量、结构式等信息见表 1。
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表 1 2种色素信息一览表 Table 1 The information of tartrazine and metanil yellow |
Merck公司硅胶G薄层板。Agilent公司1200高效液相色谱仪（配有四元梯度泵、DAD检测器）；Waters公司Sunfire C18（150 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）色谱柱，Agilent公司ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）色谱柱。Agilent公司1290-6540飞行时间质谱仪。WIGGENS公司UE10SFD超声波清洗器。丹佛公司DENVER TB-225D电子分析天平。
乙腈为色谱纯试剂，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。柠檬黄对照试剂，中国食品药品检定研究院，批号510004-201401，供HPLC检查用，以C16H9N4Na3O9S2计，含量为91.0%，使用前不需干燥处理；酸性黄36对照试剂，Dr.Ehrenstorfer GmbH，批号C10029500，以C18H14N3NaO3S计，含量为99.0%。蒲黄对照药材，中国食品药品检定研究院，批号为121225-201003。药材样品蒲黄134批，均为2015年国家评价性抽验样品。
1.2 溶液的配制 1.2.1 对照溶液取对照试剂柠檬黄和酸性黄36适量，分别加70%乙醇制成每1 mL中各含0.5 mg的溶液，作为柠檬黄对照试剂溶液Ⅰ和酸性黄36对照试剂溶液Ⅰ（TLC用）；取对照试剂柠檬黄和酸性黄36适量，加70%乙醇制成每1 mL中各含0.05 mg的混合溶液，作为对照试剂混合溶液Ⅱ（HPLC用）；取对照试剂柠檬黄和酸性黄36适量，加70%乙醇制成每1 mL中各含0.01 mg的混合溶液，作为对照试剂混合溶液Ⅲ（TLC和HPLC用）。
1.2.2 供试品溶液取蒲黄粉末2 g，加70%乙醇20 mL，密塞，超声处理（功率90 W，频率40 kHz）20 min，离心（转速为4 000 r·min-1，时间为5 min），取上清液作为供试品溶液。
1.2.3 阴性样品溶液取蒲黄对照药材粉末，同供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。
2 柠檬黄和酸性黄36的TLC检查 2.1 TLC检查结果取上述“1.2”项下供试品溶液和对照试剂溶液Ⅰ各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水-水（1:3:3:1:1）为展开剂，展开，取出，晾干；日光下检视[10-11]。结果在134批供试品色谱中，4批疑似检出柠檬黄，3批（样品2、样品3、样品4）疑似检出酸性黄36，见图 1。将采用HPLC-DAD法进行验证。
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1、2.阴性样品溶液（test solution of negative samples）3~6. 4个阳性样品的供试品溶液（test solution of four potential dyed samples）7.酸性黄36对照试剂溶液Ⅰ（solution Ⅰ of metanil yellow reference reagent）8.柠檬黄对照试剂溶液Ⅰ（solution Ⅰ of tartrazine reference reagent） 图 1 疑似染色蒲黄样品TLC图 Figure 1 TLC chromatograms of the potential dyed Typhae Pollen |
取“1.2”项下柠檬黄对照试剂溶液Ⅰ和酸性黄36对照试剂溶液Ⅰ、疑似含染色剂样品的供试品溶液和阴性样品溶液，按“2.1”项下方法进行试验，结果阴性样品溶液无干扰。
2.3 检出限的考察取“1.2”项下对照试剂混合溶液Ⅲ，以不同点样量按“2.1”项下方法进行试验，见图 2。结果显示，当大于或者等于对照试剂混合溶液Ⅲ（柠檬黄质量浓度为10.18 μg·mL-1，酸性黄36质量浓度为10.72 μg·mL-1）浓度时，可见柠檬黄和酸性黄36斑点。故本方法柠檬黄的最低检出限为0.03 µg，酸性黄36的最低检出限为0.05 µg。
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1~7.对照试剂混合溶液Ⅲ，点样量依次为1、3、5、7、10、11、12 μL（mixed solution Ⅲ of reference reagents，the sampling volume were 1，3，5，7，10，11 and 12 μL，from left to right） 图 2 柠檬黄及酸性黄36检出限 Figure 2 Detection limit of artrazine and metanil yellow |
采用Sunfire C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇为流动相A，0.2 mol·L-1的乙酸铵溶液为流动相B，梯度洗脱（0~10 min，12%A，88%B；10~15 min，12%A→90%A，88%B→10%B；15~20 min，90%A→12%A，10%B→88%B；20~30 min，12%A，88%B）。采用二极管阵列检测器，在428 nm波长处检测柠檬黄，在422 nm波长处检测酸性黄36。理论板数按柠檬黄对照试剂色谱中的主峰计算不低于3 000[12-14]。
3.2 专属性的考察取对照试剂混合溶液Ⅱ、疑似含染色剂样品的供试品溶液、阴性样品溶液，分别进样，进行液相色谱的考察，结果供试品溶液呈现与柠檬黄对照试剂或酸性黄36对照试剂保留时间相同的色谱峰，阴性样品溶液未检出与2种对照试剂相同的色谱峰，见图 3。并扫描柠檬黄及酸性黄36色谱峰在200~600 nm波长范围的紫外-可见吸收光谱，见图 4。进行峰纯度检查，结果其纯度因子均在990以上，从而证明该方法符合专属性要求。
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图 3 对照试剂混合溶液Ⅱ（A）、酸性黄36阳性样品的供试品溶液（B）、柠檬黄阳性样品的供试品溶液（C）和阴性样品溶液（D）的HPLC-DAD色谱图 Figure 3 The HPLC-DAD chromatograms of mixed solution Ⅱ of tartrazine and metanil yellow reference substances(A), test solution of positive sample dyed with metanil yellow(B), test solution of positive sample dyed with tartrazine(C)and test solution of negative samples(D) |
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图 4 柠檬黄对照品（A）、柠檬黄阳性样品（B）和酸性黄36对照品（C）、酸性黄36阳性样品（D）HPLC-DAD色谱峰的光谱图 Figure 4 The UV spectrograms of tartrazine reference substance(A), positive sample dyed with tartrazine(B)metanil yellow reference substance(C)and positive sample dyed with metanil yellow(D) |
取不同低浓度的柠檬黄和酸性黄36的对照试剂溶液，按“3.1”项下色谱条件进行测定。以信噪比为3:1的量确定为其检测限，结果本方法能检出柠檬黄和酸性黄36的仪器检测限分别为0.46 ng和0.25 ng。
3.3.2 方法检测限的确定精密吸取不同体积的对照试剂混合溶液Ⅲ，分别置具塞锥形瓶中，减压蒸干，再精密加入蒲黄对照药材2 g，按“3.1”项下色谱条件进行测定。以信噪比为3:1的量确定为其检测限，结果本方法能检出柠檬黄和酸性黄36的方法检测限分别为0.52 ng和0.35 ng。
3.3.3 疑似检出染色样品测定取对照试剂混合溶液Ⅱ，TLC法中疑似检出柠檬黄、酸性黄36的供试品溶液及阴性样品溶液（70%乙醇），按“3.1”项下色谱条件进行HPLC-DAD测定。结果显示，4批样品中有3批（样品1、样品2、样品3）疑似检出柠檬黄，其中1批（样品3）紫外光谱图不完全相同。酸性黄36检测结果与TLC法相同，即3批（样品2、样品3、样品4）均疑似检出酸性黄36。
3.4 建立另一色谱系统对该定性方法的验证采用Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈为流动相A，0.05 mol·L-1的乙酸铵溶液为流动相B，梯度洗脱（0~40 min，5%A→50%A，95%B→50%B），采用二极管阵列检测器，在428 nm波长处检测柠檬黄，在422 nm波长处检测酸性黄36。理论板数按柠檬黄对照试剂色谱中的主峰计算不低于3 000。
建立了不同于原流动相系统的甲醇-乙酸铵溶液流动相体系进行验证，结果与原流动相系统一致，供试品溶液呈现与柠檬黄对照试剂或酸性黄36对照试剂保留时间相同的色谱峰，见图 5。证明所建立的柠檬黄、酸性黄36 HPLC-DAD定性方法结果准确。
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图 5 柠檬黄、酸性黄36对照试剂混合溶液Ⅱ（A）和阳性样品供试品溶液（B）HPLC-DAD色谱图 Figure 5 The HPLC-DAD chromatograms of mixed solution Ⅱ of tartrazine and metanil yellow reference substances(A)and test solution of the potential dyed sample(B) |
采用Agilent公司1290-6540飞行时间质谱仪。以乙腈-0.02 mol·L-1乙酸铵为流动相系统；质谱检测参数：装配有电喷雾离子源，扫描方式为ESI+扫描，去溶剂雾化气氮气流速9 L·min-1，喷雾压力310 kPa，雾化气温度325 ℃，毛细管电压3 500 V，碎裂电压135 V，同时进行一级质谱全扫描、二级质谱全扫描，扫描范围m/z 100~600 [13-14]。
4.2 疑似检出染色样品测定取对照试剂混合溶液Ⅱ，TLC法中疑似检出柠檬黄、酸性黄36样品的供试品溶液，按“4.1”项下条件进行HPLC-MS测定，结果见表 2、图 6。在染色样品色谱中，与柠檬黄、酸性黄36相应色谱峰具有相同的质谱特征。4批样品中有1批（样品1）检出柠檬黄，3批（样品2、样品3、样品4）检出酸性黄36。
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表 2 对照试剂质谱信息 Table 2 The mass information of reference substances |
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图 6 柠檬黄对照试剂（A）、酸性黄36对照试剂（B）和4个阳性样品（C、D、E、F）离子扫描图 Figure 6 The mass spectrograms of tartrazine reference substance(A), metanil yellow reference substance(B)and 4 dyed samples(C, D, E, F) |
经TLC法、HPLC-DAD法和HPLC-MS法检测，最后确定蒲黄1批样品中检出柠檬黄，3批样品中检出酸性黄36。
本文建立了同时检查柠檬黄、酸性黄36的TLC法、HPLC-DAD法和HPLC-MS法，可用于定性检查。
6 讨论 6.1 蒲黄非法染色现状通过本项目研究，提示当前市场上的蒲黄染色情况严重，除用前几年发现的金胺O进行染色外，又出现了用柠檬黄进行染色，还首次检出酸性黄36用于药材的染色，染色依然是影响蒲黄药材及饮片质量的主要问题，且有用多种染色剂进行染色的趋势。
6.2 染色检查方法优缺点研究提示，染色的检查方法各有优缺点。TLC简便快捷，可以对大批量样品进行快速筛查；HPLC-DAD可对疑似样品做初步确认，并可以进行定量测定；而HPLC-MS可确定染色情况，从而避免假阳性的产生。
6.3 样品提取方法考察本实验参照蒲黄中金胺O检查的补充检验方法（2007007）以及西红花中多种色素检查的补充检验方法（2011001）进行，用70%乙醇进行直接提取，较为简单，快捷，实用。
6.4 HPLC-DAD方法考察HPLC-DAD法中，采用DAD检测器在200~600 nm波长范围内对供试品液中的柠檬黄和酸性黄36色谱峰进行扫描，柠檬黄最大吸收波长为258 nm，428 nm；酸性黄36最大吸收波长为270 nm、422 nm。鉴于在低波长下2种色素的测定杂质峰干扰较大，所以选择428 nm和422 nm为测定波长。实验过程中曾采用甲醇-乙酸铵溶液流动相体系，结果发现柠檬黄出峰时间基本都在3 min左右，采用乙腈-乙酸铵溶液流动相体系能够使其出峰时间较晚，故选择该体系。
6.5 建议因柠檬黄HPLC保留较弱，建议采用250 mm规格色谱柱；DAD检测以428 nm附近是否出现最大吸收峰为主要判断依据。
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