复方石韦制剂其方源自清·李用粹的《证治汇补》中的石韦散，经化裁以石韦、黄芪、苦参、萹蓄组方，临床上用于小便不利、尿频、尿急、尿痛及下肢水肿等淋症^[1-2]，其片剂形式收载于2010年版、2015年版中国药典一部中。按照药典^[3-4]要求，仅采用RP-HPLC测定苦参碱、黄芪甲苷的含量。现有的研究尚有针对苦参碱、氧化苦参碱等生物碱^{[1, 5-7]}、绿原酸、香草酸等有机酸类成分^[7-8]进行测定的报道。然而，随着化学成分及药理活性研究的深入，黄酮类化学成分越来越不容忽视^[9-11]。复方石韦制剂中亦含有较大量黄酮^[12-15]，其中苦参酮、槐属二氢黄酮G、异黄腐醇以及三叶豆紫檀苷等均具有显著的杀虫、抗菌^[16-22]作用，这对于淋症的治疗有重要意义。然而，至今仅有针对芦丁进行含量测定的报道^[7]。鉴于此，本文建立了同时测定复方石韦胶囊中苦参酮、槐属二氢黄酮G、异黄腐醇以及三叶豆紫檀苷含量的HPLC方法，该内容国内外未见相关报道。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Waters 2695-2996型高效液相色谱仪(Waters公司)；Diamonsil C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；北京迪马科技有限公司)；Milli-Q纯水机(Millipore公司)；FA2004万分之一分析电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；SB-5200D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试药

复方石韦胶囊(陕西东泰制药有限公司，批号20150706、20150918、20151204，规格为0.5 g·粒^-1)；苦参酮、槐属二氢黄酮G、异黄腐醇、三叶豆紫檀苷的对照品均为实验室自制，采用乙酸乙酯提取苦参干燥根，提取物经正相硅胶柱层析、ODS反相柱层析分离纯化，经UV、IR、MS及NMR鉴定结构，HPLC检测面积归一化法计算纯度均大于98%；甲醇为色谱纯，水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

采用Diamonsil C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱(0~14 min，12%A→30%A；14~24 min，30%A→45%A；24~44 min，45%A→65%A；44~54 min，65%A；54~59 min，65%A→70%A；59~69 min，70%A；69~75 min，70%A→75%A；75~90 min，75%A→90%A)，流速1 mL·min^-1，柱温30 ℃，检测波长300 nm，进样量20 μL。

2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品储备液

分别取苦参酮、槐属二氢黄酮G、异黄腐醇和三叶豆紫檀苷的对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1 mL分别含苦参酮0.342 mg、槐属二氢黄酮G 0.1635 mg、异黄腐醇0.0425 mg及三叶豆紫檀苷0.185 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液

取本品10粒，除去胶囊壳，内容物混匀，精密称定，研细；取粉末适量(约3.5 g)，精密称定，加入乙酸乙酯140 mL，称量，超声(功率300 W，频率25 kHz)处理30 min，放冷，再称量，用乙酸乙酯补足减失的量，摇匀，滤过，以40 mL乙酸乙酯分2次洗涤残渣，过滤，合并滤液，回收溶剂至干，残渣加甲醇约3 mL使溶解，并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察 2.3.1 空白试验

按“2.1”项下色谱条件，分别将空白溶剂(甲醇)、混合对照品储备液及供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图 1。三叶豆紫檀苷、异黄腐醇、苦参酮和槐属二氢黄酮G的保留时间分别为35.75、50.82、63.48和69.44 min，且溶剂对样品含量测定无干扰。

2.3.2 线性关系考察

精密吸取按“2.2.1”项下方法制备的混合对照品储备液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL，分别置10 mL量瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀，即得系列质量浓度的混合对照品溶液。分别吸取上述系列混合对照品溶液各20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积(Y)对进样质量(X)进行线性回归，得回归方程，结果见表 1。

2.3.3 精密度试验

取同一供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图及峰面积。结果苦参酮、槐属二氢黄酮G、异黄腐醇和三叶豆紫檀苷峰面积的RSD分别为0.54%、0.97%、1.51%和0.69%，表明精密度符合要求。

2.3.4 稳定性试验

取同一供试品溶液分别于0、2、4、6、8、12 h分别进样20 μL，测定苦参酮、槐属二氢黄酮G、异黄腐醇和三叶豆紫檀苷的峰面积并计算RSD，结果分别为0.68%、0.73%、1.18%和0.75%，表明供试品溶液可在12 h内测定而对结果没有影响。

2.3.5 重复性试验

取同一批复方石韦制剂，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定各成分的峰面积，计算苦参酮、槐属二氢黄酮G、异黄腐醇和三叶豆紫檀苷平均含量分别为96.56、47.32、12.11、58.26 µg·粒^-1，RSD分别为1.4%、0.98%、1.6%、1.2%。结果表明本法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验

取已知含量的复方石韦胶囊粉末6份，每份约1.75 g，精密称定。分别精密加入混合对照品储备液1.0 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰峰面积，计算加样回收率，结果见表 2。4个成分的平均回收率在99.2%~101.5%之间，RSD在1.3%~2.2%之间，表明回收率符合要求。

2.4 样品含量测定

取3批复方石韦胶囊样品各3份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图及峰面积，由回归方程计算4个成分的含量，结果见表 3。

3 讨论

针对黄酮类成分的提取，预实验中考察了不同的提取溶剂，如甲醇、乙醇、80%甲醇、80%乙醇水溶液、乙酸乙酯、石油醚；不同的提取方法，如回流、超声、渗滤法；不同的溶剂量，如20倍、30倍、40倍、50倍。结果表明，以乙酸乙酯为提取溶剂(40倍量)超声30 min的效果最佳，待测成分提取率高、杂质少。

4个黄酮成分在200~600 nm全波长扫描，分别在299.3 nm(苦参酮)、296.4 nm(槐属二氢黄酮G)、291.7 nm(异黄腐醇)和309.5 nm(三叶豆紫檀苷)处有最大吸收波长，且吸收峰为较对称峰形，在300 nm处4个黄酮成分吸收均较强，因此在本试验条件下测定波长选择300 nm。流动相分别考察了乙腈-水、甲醇-水梯度洗脱系统，结果后者即可实现较好的分离，且可降低成本。

本研究建立了灵敏、准确的HPLC-DAD法同时检测复方石韦胶囊中苦参酮、槐属二氢黄酮G、异黄腐醇以及三叶豆紫檀苷4种黄酮成分，为提高该制剂的质量控制提供了有价值的参考。