2017, Vol. 37 
牛黄清感胶囊是由黄芩、金银花、连翘、人工牛黄、珍珠母共5味药材组成的，具疏风解表、清热解毒之功效[1]，并且有研究发现其对甲型H3N2流感病毒抑制和预防的作用[2]。牛黄清感胶囊为2015年版中国药典新收录的中药制剂，2015年版中国药典通过测定黄芩苷的含量对其进行质量控制，其中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素是黄芩中起主要作用的成分，绿原酸和连翘苷分别是是金银花和连翘中起主要作用的成分，有关牛黄清感胶囊的含量测定和质量控制文献较少，都是测定其中1种药物成分[3-4]，目前未见同时测定此药多种组分含量的报道。为了更好地控制制剂质量，本文建立了高效液相色谱法同时测定绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷6个成分的含量，这对于牛黄清感胶囊的质量控制具有重要意义。
1 材料岛津公司LC-20AT高效液相色谱仪，包括SPD-M20A二极管阵列检测器、SIL-20A自动进样器、岛津LC-solution工作站；迪马科技有限公司DIKMA Platisil ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶)；Millipore公司Synergy 185超纯水仪，昆山市超声仪器有限公司KQ-250DE型数控超声波清洗器。
对照品绿原酸(批号110753-201415)、黄芩苷(批号110715-200514)，汉黄芩苷(批号112002-201501)，黄芩素(批号111595-201306)，汉黄芩素(批号111514-201304)，连翘苷(批号0812-200104) 均购自中国食品药品检定研究院；牛黄清感胶囊(黑龙江澳利达奈德制药有限公司，批号14070305、14050702、14090408)。乙腈为色谱纯，水为超纯化水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 对照品溶液的制备精密称取汉黄芩苷对照品4.2 mg，置10 mL量瓶中，以甲醇定容，即得汉黄芩苷储备液；精密称取绿原酸、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷的对照品适量及汉黄芩苷储备液1 mL，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇定容，制成含绿原酸0.164 mg·mL-1、黄芩苷0.106 mg·mL-1、汉黄芩苷0.042 mg·mL-1、黄芩素0.026 25 mg·mL-1、汉黄芩素0.015 mg·mL-1、连翘苷0.033 3 mg·mL-1的混合对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备取牛黄清感胶囊内容物1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇50 mL，密塞，称量，超声(250 W，40 kHz)处理30 min，放冷，再称量，用50%甲醇补足减失的量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液[1]。
2.3 阴性样品溶液的制备按处方分别制备缺少金银花、黄芩、连翘的阴性样品，按“2.2”项方法操作，即得阴性样品溶液。
2.4 色谱条件色谱柱：DIKMA Platisil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0~20 min，10%A→16%A；20~40 min，16%→30%A；40~60 min，30%→40%A；60~80 min，40%A)；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：278 nm(绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素)、210 nm(连翘苷)；进样量：10 μL。在上述色谱条件下，各待测组分分离度均大于1.5、理论塔板数均大于5 000。混合对照品溶液、样品溶液及各阴性样品溶液色谱图见图 1、2。
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1.绿原酸(chlorogenic acid) 2.黄芩苷(baicalin) 3.汉黄芩苷(wogonoside) 4.黄芩素(baicalein) 5.汉黄芩素(wogonin) 图 1 混合对照品(A)、样品(B)、不含黄芩的阴性样品(C)、不含金银花的阴性样品(D)在278 nm处色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A), sample (B), negative sample without Scutellariae Radix (C) and negative sample without Lonicerae Japonicae Flos (D) at 278 nm |
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6.连翘苷(phillyrin) 图 2 混合对照品(A)、样品(B)、不含连翘的阴性样品(C)在210 nm处色谱图 Figure 2 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A), sample(B), and negative sample without Forsythiae Fructus(C)at 210 nm |
精密吸取混合对照品溶液1、5、8、10、15、20 μL进样测定；以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标进行线性回归，得绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷的线性回归方程见表 1。
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表 1 绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷线性的回归方程 Table 1 Linear regression equations of chlorogenic acid, baicalin, wogonoside, baicalein, wogonin and phillyrin |
取混合对照品溶液，按“2.4”项下色谱条件连续进样6次，测得混合对照品中绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷峰面积的RSD(n=6) 分别为0.44%、0.36%、0.34%、0.29%、0.71%、0.58%。
2.7 稳定性试验取同一供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、12、24 h进行测定，测得绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷峰面积的RSD(n=6) 分别为0.85%、0.81%、0.68%、0.42%、0.74%、0.79%，表明供试品溶液在常温下24 h内稳定。
2.8 重复性试验取牛黄清感胶囊样品，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，以“2.4”项下色谱条件进行测定，得绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷的平均含量(n=6) 分别为0.759、34.223、1.401、0.782、0.519、0.735 mg·g-1，RSD分别为0.96%、1.06%、0.88%、0.93%、1.1%、0.78%。
2.9 加样回收率试验精密称取“2.8”项已测知含量样品约0.5 g，共9份，平均分为3组，按低、中、高浓度(0.8倍、1倍、1.2倍)分别加入一定量的绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷对照品，按照“2.2”项下方法制备供试溶液，进样10 μL进行测定，结果绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘苷的平均回收率(n=9) 分别为99.6%、99.3%、100.7%、99.6%、100.2%、99.6%，RSD分别为1.2%、1.1%、1.4%、1.2%、1.5%、1.8%。
2.10 样品含量测定取3批样品各1.0 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样测定，以外标法计算待测成分含量，结果见表 2。
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表 2 牛黄清感胶囊中6个成分的测定(mg·g-1，n=3) Table 2 Determination of six components in Niuhuang Qingan Capsules |
由于牛黄清感胶囊是2015年版中国药典中新收录的中成药，所以相关文献较少，在流动相的选择上，笔者考察了乙腈-磷酸水、甲醇-磷酸水2个溶剂系统[5-13]，结果发现甲醇-磷酸水为流动相时，黄芩里的几个待测组分出峰时间较晚。采用乙腈-磷酸水时，汉黄芩素在有机相比例较高时分离度不好，所以前期有机相比例较低，导致整个分析时间较长。
3.2 波长的选择波长扫描得到绿原酸最大吸收波长为327 nm，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素为278 nm，连翘苷为210 nm。278 nm虽然不是绿原酸的最大吸收波长，但是由于其在制剂中含量相对较高，采用278 nm作为测定波长能够达到方法学考察的要求，得到合格的色谱峰，考虑到同一波长下测定使得方法更加简单，增加了普适性，所以绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素选择278 nm作为检测波长。
3.3 样品处理本研究在样品的处理上，参考了中国药典中的处理方法[1]，但是浓度提高了几倍，因为在测定的过程中发现此药中黄芩苷含量特别高，完全按药典中的处理方法，其余几种成分含量相对较少，测定较困难，因此提高了供试品溶液的浓度。
3.4 总结牛黄清感胶囊对甲型H1N1、H3N2流感病毒及其他病毒都具有治疗及预防的作用[2, 14-15]，市场发展空间很大，需要提高质量要求。本药由由黄芩、金银花、连翘、人工牛黄、珍珠母5种药物组成，本实验测定了含量最高也是起主要作用的前3种药物，对提高此种药物质量控制具有重要的意义。
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