单磷酸阿糖腺苷属于人工合成的嘌呤核苷类化合物，是阿糖腺苷的磷酸化产物，目前已成为继干扰素后销量最大的治疗乙肝病毒用药，比更昔洛韦更受欢迎的治疗疱疹病毒感染及性病用药^[1-2]。其质量标准采用国家食品药品监督管理总局新药转正标准，17个生产厂家各自标准不同，其含量测定的方法主要采用高效液相色谱法及紫外分光光度法。当前，为了更好地控制药品的质量，国家大力倡导发展快检事业，建立现场、快速、简便的药品测定方法势在必行。

近红外漫反射光谱（near infrared diffuse reflectance spectroscopy，NIRDRS）分析技术是集光谱分析技术、计算机技术和化学计量学技术为一体的现代光谱技术，主要用于样品的无损、快速分析。近年来我国开始将NIR光谱分析技术用于食品、药品快速定性、定量、水分控制及在线检测等方面^[3-5]，对药品的监管具有特别的意义。

本文采用近红外漫反射光谱法及偏最小二乘算法^[6-7]建立多厂家注射用单磷酸阿糖腺苷通用性定量分析模型。模型一经建立，可现场快速测定任一厂家注射用单磷酸阿糖腺苷的含量，几分钟便可完成，不破坏样品，不消耗试剂，操作简单，结果准确。

1 仪器及试药 1.1 仪器

Matrix-F近红外光谱仪（德国Bruker公司），配有1.5 m长固体光纤探头测样附件，铟镓砷（InGaAs）检测器，OPUS5.5光谱分析软件（德国Bruker公司）。

Lambda-35双光束紫外分光光度计（美国PE公司），高效液相色谱仪（美国Waters公司），BP211D电子分析天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 样品

17个厂家生产的133批注射用单磷酸阿糖腺苷，均为陕西省食品药品检验所抽验样品；单磷酸阿糖腺苷对照品（中国食品药品检定研究院，0350-200001，651 u·mg^-1，规格：200 mg）。

2 实验方法 2.1 含量测定

照各企业执行标准，分别采用紫外分光光度法及高效液相色谱法测定。

2.2 NIR光谱测定

采用漫反射采样方式。以固体光纤探头抵住西林瓶底部，采集样品的NIR漫反射光谱。光谱采集条件：光谱扫描范围为12 000~4 000 cm^-1，分辨率8 cm^-1，室温，扫描次数64次，每批样品测定6瓶作为原始光谱，再求平均光谱作为建模光谱。

2.3 定量模型的建立

采用OPUS5.5光谱分析软件附带的定量2软件包，运用偏最小二乘法建立初步的定量校正模型。模型预测准确性用交叉验证均方根误差（root mean square errors of cross validation，RMSECV）（式1）和外部验证均方根误差表示（root mean square errors of prediction，RMSEP）表示（式2）。

${\rm{RMSECV}} = \sum\limits_{i = 1}^{{N_C}} {\frac{{{{\left( {{{\mathord{\buildrel{\lower3pt\hbox{$\scriptscriptstyle\frown$}} \over Y} }_{CVi}} - {Y_i}} \right)}^2}}}{{{N_C}}}} $

(式1)

式1中, ${{{\mathord{\buildrel{\lower3pt\hbox{$\scriptscriptstyle\frown$}} \over Y} }_{CV}}}$_i:交叉验证中样品i的预测值；Y_i：同一样品的真实测定值；N_C：校正集样品的数量。

${\rm{RMSEP}} = \sum\limits_{i = 1}^{{N_i}} {\frac{{{{\left( {{{\mathord{\buildrel{\lower3pt\hbox{$\scriptscriptstyle\frown$}} \over Y} }_i} - {Y_i}} \right)}^2}}}{{{N_i}}}} $

(式2)

式2中， ${{{\mathord{\buildrel{\lower3pt\hbox{$\scriptscriptstyle\frown$}} \over Y} }_i}}$ 和Y_i分别为外部验证中样品i的真实测定值及预测值；N_i验证集样品数量。

3 结果与讨论 3.1 校正集和验证集样品的选择

由于建模样品量较大，采用外部验证法建模。根据软件自带的自动分离原理从收集到的133批样品中选择了68批作为校正集样本，含量范围为46.79%~97.25%；剩余65批样品作为验证集样本，含量范围为47.89%~94.49%。

随机选取校正集和验证集样本^[8]时，所建立定量校正模型的RMSECV和RMSEP值均大于5%，显见是由于校正集样本的性质未涵盖所有验证样品的特性。尽管不同厂家、不同批次的注射用单磷酸阿糖腺苷的活性成分相同，但是制剂中辅料的种类、数量以及生产工艺仍存在差异。自动分离^[9]采用“主成分重心法”，即利用样品光谱的主成分特征向量，与样品平均光谱的主成分特征向量之间的距离值，按从小到大排序，并按一定间隔来挑选样品的方法。因此，实验中按照自动分离的原理来合理分配校正集和验证集样本，挑选68批有代表性的样品作为训练集建立模型，其余65批样品作为验证集。最终，所建模型的RMSECV和RMSEP分别减小到2.24%和2.69%。

3.2 NIR校正模型

选取特定建模谱段、适当的光谱预处理方法及合理的化学计量学方法以突出活性成分的信息，建立稳健的NIR校正模型。

3.2.1 建模谱段的选择

样品近红外光谱大于10 000 cm^-1的末端吸收较弱且容易形成噪音干扰，小于4 200 cm^-1会因为边缘效应和和噪音形成干扰，故选择建模谱段时避开此区域^[10-12]，同时，优先选择有活性吸收的谱段。谱段10 000~7 500 cm^-1图谱较平，此区域吸收活性吸收较小，谱段7 502.3~6 098.2 cm^-1和5 450.2~4 597.8 cm^-1主要为C-H、N-H基团的倍频振动吸收区，由活性成分吸收引起，结合模型各项参数优劣，最终选取该谱段作为建模谱段，见图 1。

选取不同谱段建立NIR模型并根据RMSECV、R²及Rank值做一比较，结合OPUS软件自动优化的结果，最终选取7 502.3~6 098.2 cm^-1和5 450.2~4 597.8 cm^-1为建模谱段，其RMSECV及RMSEP最小，R₂最大且Rank值^[13]在6~10之间，预测准确性及稳健性均良好。表 1为选取不同谱段的建模结果，表明模型1所选谱段最优。

3.2.2 光谱预处理方法的选择

实验选取一阶导数（first derivative，FD）与多元散射校正（multiple scattering correction，MSC）相结合的预处理方法，13点平滑。FD与MSC相结合的预处理方法有效地消除散射影响，增强了与成分含量相关的光谱吸收信息。同时，可改善背景干扰，分辨重叠峰，提高分辨率和灵敏度；平滑处理是消除噪声常用的方法。建模样品的原始NIR漫反射光谱如图 2所示，经FD、MSC及平滑预处理后的光谱如图 2所示，可知光谱经过预处理之后，降低了背景及噪声干扰，提高了信噪比，增强了光谱特征。

3.2.3 最优模型的确定

结合OPUS软件自动优化结果、模型稳健性理论及外部验证结果，在多次尝试后，认为最优模型的参数如表 2所示。其外部验证相关性结果如图 4、图 5所示。

3.3 模型验证 3.3.1 准确性

选取未参与建模的5个不同厂家的15批注射用单磷酸阿糖胞苷来测试所建模型的准确性。NIR预测值与真值比较，平均偏差为0.36%，最大偏差为2.73%；平均相对偏差为0.65%，最大相对偏差为3.60%。均小于近红外快速检测对于偏差的限度要求5%。同时，将验证集样品NIR结果与HPLC方法结果在95%可信区间内进行配对t检验，在95%可信区间范围内，p值为0.642，大于0.05，表明所建模型NIR预测结果与参考方法结果没有显著性差异，结果见表 3。

3.3.2 专属性

所建模型的马氏距离阈值为0.21，选择10批注射用单磷酸阿糖腺苷（T）测试模型的专属性。所有样品测试结果均为通过，其马氏距离均小于0.21。另取结构相似，同剂型品种注射用三磷酸胞苷二钠（S）测试，3批样品均未通过，其马氏距离均大于模型阈值，见表 4。表明模型的专属性良好。

3.3.3 线性

近红外为二级方法，一般采用多元回归，通常用待分析物的NIR预测结果与参考值之间的关系来评价其线性。线性方程：

$Y = 0.999\,1X - 0.082\,2\quad r = 0.988\,0$

(3)

3.3.4 精密度

本文以重复性和中间精密度来考察该方法的精密度，方法及结果见表 5。

4 结论

所建立的注射用单磷酸阿糖腺苷近红外定量分析模型专属性、预测准确性、稳健性及重复性均良好。实际应用时，仅需测量未知样品光谱，代入模型，数分钟便可得出其含量值，较之传统检测方法具有快速、简便，不消耗试剂，可现场检测等优势。可用于市场、偏远地区的药品打假及质量控制，也可用于生产企业在线监测药品质量。