2017, Vol. 37 
茯苓是多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核[1]，是中国传统的药食两用中药材，为中药八珍之一，性味甘、淡，平；归心、肺、脾、肾经；能利水渗湿，健脾，宁心。用于水肿尿少，痰饮眩悸，脾虚食少，便溏泄泻，心神不安，惊悸失眠。现代研究表明，茯苓具有抗肿瘤、抗炎、抗衰老、调节免疫、保肝等药理作用。茯苓正广泛应用于保健食品和药品的开发，对其化学成分研究主要集中在茯苓多糖、三萜类化合物上[2]，而其富含的氨基酸、蛋白质、微量元素等营养成分的研究较少，药材标准较低，2015年版中国药典仅有药材的理化鉴别及对水分、总灰分和浸出物检查，并无含量测定项及其他质量控制内容。氨基酸是蛋白质的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质，是人体的必需营养成分之一。研究茯苓中氨基酸的组成和含量，对评价这类药食两用中药的质量，有一定的指导意义。
目前，常用的氨基酸检测方法有氨基酸分析仪-柱后衍生法[3-4]、柱前衍生-蒸发光散射检测器法[5-7]、高效阴离子交换色谱积分脉冲安培检测法[8]。氨基酸分析仪虽是氨基酸测定的专有仪器，但设备昂贵，且方法所用试剂量大，测试成本较高[9]。与柱后衍生法相比，柱前衍生法的检测限灵敏度高，衍生化产物稳定，且简便可靠。常用的柱前衍生剂有异硫氰酸苯酯（PITC）、邻苯二甲醛-巯基乙醇（OPA）[10]、6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）[11]、丹磺酰氯（DANSYL-CL）[12]和9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）[13]等。PITC作为最常用的柱前衍生剂，操作方便、稳定、可靠，衍生后可直接进样。本实验采用PITC柱前衍生高效液相色谱法分析不同产地茯苓中氨基酸含量，拟通过氨基酸评价茯苓药材质量，为菌类药材的质量标准研究提供参考。
1 仪器与试药Waters e2695-2998高效液相色谱仪（含PDA检测器，Empower 3色谱工作站）；Phenomenex Gemini C18 110A色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国菲罗门）；BP115D电子天平（Sartorius，d=0.1 mg）；XW-80A涡旋混合器（上海青浦沪西仪器厂）；Sorvall ST 8离心机（Thermo）；Biofuge primo R高速离心机（Thermo）；KQ-400GKDV超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；HH S21-4S电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）。
醋酸钠、盐酸为优级纯，正己烷、三乙胺、乙腈、冰醋酸为色谱纯，异硫氰酸苯酯（PITC）为分析纯，试验用水为去离子水（由Milli-Q超纯水机制备）。
18种氨基酸对照品：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、胱氨酸（Cys）、色氨酸（Trp），批号200805，购自中国食品药品检定研究院。
12批茯苓药材分别来源于云南楚雄、云南大理、安徽金寨、湖北罗田、河南新乡、贵州都匀、四川成都、广西玉林、福建莆田、湖南岳阳、浙江磐安、河北安国12个产地，经苏州市食品药品检验所顾炳仁教授鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核。
2 方法与结果 2.1 色谱条件采用Phenomenex Gemini C18 110A色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为43 ℃，流动相A为0.1 mol·L-1醋酸钠缓冲液（以醋酸调pH 6.5）-乙腈（93:7），流动相B为乙腈-水（4:1），梯度洗脱程序见表 1，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为254 nm，进样量为10 μL。
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表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program |
分别取18种氨基酸对照品适量，精密称定，加0.1 mol·L-1盐酸溶液制成每1 mL含Asp 0.11 mg，Glu 0.11 mg，Ser 0.12 mg，Gly 0.12 mg，His 0.11 mg，Arg 0.06 mg，Thr 0.12 mg，Ala 0.12 mg，Pro 0.12 mg，Tyr 0.11 mg，Val 0.11 mg，Met 0.11 mg，Ile 0.11 mg，Leu 0.11 mg，Phe 0.12 mg，Lys 0.11 mg，Cys 0.11 mg，Trp 0.11 mg的混合溶液，即得混合对照品储备液。取上述溶液400 μL，置于EP管中，加入1 mol·L-1的三乙胺乙腈溶液200 μL，0.1 mol·L-1异硫氰酸苯酯乙腈溶液200 μL，混匀，室温避光放置1 h，加入正己烷800 μL，涡旋振荡，放置10 min，5 000 r·min-1离心5 min，取下层溶液，制得衍生化溶液，即混合对照品衍生化溶液[14]。
2.2.2 供试品衍生化溶液[15]取样品粉末（过4号筛）0.2 g，精密称定，置10 mL安瓿中，加入6 mol·L-1盐酸溶液5 mL，混合，密封，于150 ℃水解1 h，放冷，转移至蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加0.1 mol·L-1盐酸溶液超声（功率400 W，频率40 kHz）使溶解，并转移至2 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸定容至刻度，混匀；取400 μL，置于EP管中，按“2.2.1”项下方法自“加入1 mol·L-1的三乙胺乙腈溶液200 μL”起操作，制备衍生化溶液，即得供试品衍生化溶液。
2.2.3 空白衍生化溶液取0.1 mol·L-1盐酸溶液400 μL，置于EP管中，按“2.2.1”项下方法自“加入1 mol·L-1的三乙胺乙腈溶液200 μL”起操作，制备衍生化溶液，即得空白衍生化溶液。
2.3 系统适用性试验取混合对照品衍生化溶液、供试品衍生化溶液及空白衍生化溶液各10 μL，按“2.1”项下条件进行检测，18种氨基酸衍生物色谱峰分离度良好，空白无干扰，色谱图见图 1。氨基酸对照品18个衍生物色谱峰的分离度及理论塔板数见表 2。
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1.Asp 2.Glu 3.Ser 4.Gly 5.His 6.Arg 7.Ala 8.Pro 9.Val 10.Tyr11.Met 12.Thr 13.Ile 14.Leu 15. Phe 16.Lys 17.Trp 18.Cys 图 1 空白衍生化溶液（A）、混合对照品衍生化溶液（B）、1号茯苓供试品衍生化溶液（C）HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of blank derivatization solution(A), reference substance derivatization solution(B)and No.1 Poria derivatization solution(C) |
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表 2 氨基酸对照品各衍生物峰分离度及理论板数 Table 2 Resolution and theoretical plate number for peaks of reference substances derivatives |
精密吸取“2.2.1”项下混合对照品储备液0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，分别置于2 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液定容至刻度；精密吸取上述系列溶液各400 μL，按“2.2.1”项下方法自“加入1 mol·L-1的三乙胺乙腈溶液200 μL”起操作，制备系列混合对照品衍生化溶液，按“2.1”项下条件进样10 μL，测定峰面积。分别以氨基酸质量浓度（μg·mL-1）为横坐标，相应的氨基酸衍生物峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。将上述衍生化溶液再以0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释后进样，根据峰高以信噪比S/N=3确定检出限，S/N=10确定定量限。结果见表 3。
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表 3 18种氨基酸线性关系 Table 3 The linearity relationships of 18 amino acids |
取S1样品的供试品衍生化溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定18种氨基酸衍生物进样精密度；除Glu衍生物峰面积的RSD为3.01%，其余17种氨基酸衍生物峰面积的RSD均小于2.0%，说明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验取S1样品的供试品衍生化溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、4、6、8、12、24 h进样，测定峰面积，计算RSD，考察18种氨基酸衍生物稳定性；结果18种氨基酸衍生物峰面积的RSD在0.99%~2.93%之间，说明供试品衍生化溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验精密称取S1样品6份，每份0.2 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品衍生化溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，计算18种氨基酸含量，其RSD在0.86%~2.01%之间，说明方法重复性良好。
2.8 加样回收率试验精密称取已测得含量的S1样品6份，各0.1 g，分别置10 mL安瓿中，精密加入“2.2.1”项下混合对照品储备液1.0 mL，按“2.2.2”项下方法制备衍生化溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，计算回收率和RSD，结果见表 4。
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表 4 18种氨基酸加样回收率（n=6） Table 4 The recoveries of 18 amino acids |
取茯苓样品12批，按“2.2.2”项下方法制备供试品衍生化溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定各氨基酸衍生物峰面积，峰面积代入表 3的回归方程进行计算，得到各产地氨基酸含量，结果见表 5。
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表 5 不同产地茯苓中18种氨基酸含量 Table 5 The contents of 18 amino acids in Poria from different areas |
采用SPSS 18.0对12个产地茯苓进行系统聚类，结果见图 2。
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图 2 茯苓聚类分析图 Figure 2 Dendrogram of Poria |
聚类结果表明，12批样品整体聚为3类，即S1（云南楚雄）和S4（云南大理）、S6（贵州都匀）聚为一类，S2（湖北蕲春）、S10（湖南岳阳）、S9（河南新乡）、S5（安徽金寨）4个产地样品聚为一类，其余6个产地聚为一类。
3 讨论衍生化试剂PITC的毒性大，衍生化后需要用正己烷萃取完全。氨基酸是两性物质，pH对其衍生物的分离度影响较大，因此要确保流动相的pH准确和稳定。流动相的pH显酸性，供试品溶液为碱性，当进样量偏大时，会使保留时间较短的Asp衍生物和Glu衍生物的分离度降低。各产地Trp均较少，可能是因为在酸性条件下，绝大多数氨基酸较为稳定，而Trp容易被破坏，造成检出量很低[16]。氨基酸测定常用氨基酸分析仪，需要茚三酮柱后衍生化，且Pro的波长不同于其他氨基酸，需单独测定，成本高，操作不便。而柱前衍生反相高效液相色谱法具备更强通用性，更好选择性，以及良好的灵敏度和精密度，适用于多种物质氨基酸的分析测定。本实验采用PITC柱前衍生，生成苯氨基硫甲酰衍生物，该产物稳定单一，衍生试剂杂质峰对测定峰无干扰，18种氨基酸衍生物40 min内能够完全分离，适用于茯苓药材氨基酸的快速测定。
12批茯苓药材氨基酸分布趋势基本一致，但不同产地药材各种成分的含量存在不同程度的差异，18个氨基酸衍生物以外的非共有峰的峰面积占各色谱图总峰面积的百分比均小于5%，表明各产地相似度较好。有报道，湖北、云南、安徽、贵州、四川等18个地区是与茯苓原产区生态相似度最高的区域[17]。本实验中12批药材均在此区域内，各地域生态环境因素的相似性也解释了12批药材整体质量的相近性。含量最高的氨基酸为Pro、Met和Ser，三者之和占到总氨基酸量的30%以上，不同地区的茯苓中氨基酸含有量稍有差异。根据结果，云南楚雄茯苓中氨基酸含量均较高，可能与该地区地理位置、种植品种及生态环境有一定关系。
目前，国内主要形成了2个茯苓药材的道地产区，一是云南地区的野生茯苓产区，二是大别山地区的栽培产区，包括安徽、湖北、河南等地区。茯苓的传统加工方法均需要“发汗”处理，但部分地区并不采用此种加工方式，而是挖出茯苓后直接剥皮、切制、晒干，这与各地所使用菌种类型、菌种质量有关[18]。此外，四川、福建、贵州、广西等地也有大面积引种产区。各产地的生态环境、栽培基地、病虫害防治以及GAP管理等问题也不尽相同，所有这些因素都会对茯苓药材质量产生不同程度的影响。因此，注重药材的道地性十分重要。
氨基酸这一功能物质，不仅能判断食品的营养优劣，也能广泛应用于药食两用中药的品质评价。有些氨基酸具备一定的药理活性，可开展深入研究，以期从茯苓等菌类药材中研发出功能性氨基酸食品，代替一些氨基酸补充剂，更绿色、更方便地为人所获取。同时必须关注药材的安全性，力求客观真实地评价其品质，保障用药安全。
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