2017, Vol. 37 
在中国，药用酒及酒类制品具有悠久的历史。《周礼·天宫酒人》中就有“酒掌王齐三酒，祭祀则其 < 供 > 奉之”的描述[1]。随着工业化的发展，酒的品种越来越多，生产者将酒与人参、鹿茸、海马、海参等中药及动、植物相结合，制成声称具有缓解体力疲劳功能的保健酒及酒类制品。在日常检测工作中，发现一些不法商家利用人们对于缓解疲劳、壮阳等方面的需求，将西地那非等PDE-5抑制剂及其衍生物添加于声称具有相关功能的保健酒及酒类制品中。
PDE-5抑制剂即5型磷酸二酯酶抑制剂，为选择性抑制降解环磷酸鸟苷（cGMP）特异的5型磷酸二酯酶（PDE-5），保存并增强cGMP舒张阴茎海绵体作用，使阴茎勃起。临床应用于治疗男性性功能障碍。代表性药物如西地那非、他达拉非和伐地那非。但该类药物的心血管等不良反应也屡见报道[2-3]。不法分子为宣传产品疗效，在补肾壮阳类中成药和缓解体力疲劳类保健食品中非法添加PDE-5抑制剂。针对这种情况，国家局针对补肾壮阳类中成药及抗疲劳、免疫调节类保健食品颁布了“药品检验补充检验方法和检验项目批准件补充检验方法（编号2009030）”的检测方法[4]，检测西地那非、伐地那非、他达拉非、那红地那非、红地那非、羟基豪莫西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非等11种非法添加成分。但近来出现添加多种新型PDE-5抑制剂及其衍生物的趋势，相继报道的有nitroso-prodenafil、丙氧基苯基硫代艾地那非、丙氧基苯基艾地那非、propoxphenyl hdroxyethylthiosildenafil、isonitrosoprodenafil、dithiodesethylcarbodenafil、norcarbodenafil、dithio-desmehycarbodenafil和丙氧基苯基硫代羟基豪莫西地那非等[5-10]。
本文参照“药品检验补充检验方法和检验项目批准件补充检验方法（编号2009030）”，对从市场上采购到的保健酒及酒类制品52个品种64批次样品进行检测，结果12批次保健酒或酒类制品检测到PDE-5抑制剂及其衍生物，检出率为19%。其中检出批件中涉及的西地那非、伐地那非、氨基他达拉非、羟基豪莫西地那非，另外检出5种批件中未涉及的PDE-5抑制剂衍生物丙氧基苯基艾地那非、丙氧基苯基硫代艾地那非、艾地那非、羟基硫代豪莫西地那非，且有一种未见报道的新型PDE-5抑制剂衍生物。现报道如下。
1 实验材料 1.1 样品采集主要购自本省11个地级市的零售单位、批发单位和生产企业，共52个品种64批次样品。其产地涉及13个省、市、自治区。样品来源见表 1。
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表 1 样品来源表 Table 1 Sources of the samples |
那红地那非、红地那非、伐地那非，羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非的对照品均购自加拿大TLC PHARMACHEM公司，纯度大于99%。
1.3 仪器与试药AB SCIEX Triple TOFTM 5600+质谱仪（配备岛津LC-30AD超高效液相色谱仪），Thermo Dionex U-3000高效液相色谱仪。配备岛津Shim-pack XR-ODS色谱柱（100 mm×2.0 mm，2.2 μm）和岛津Inertsil ODS-SP C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）。
乙腈、甲醇、乙酸为色谱纯，乙酸铵纯度≥99.99%，试验用水去离子水，LC-MS/MS校准液（APCI positive calibration solution，SCIEX公司提供）。
2 实验部分 2.1 检测方法参照国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件（批准件编号2009030）（简称补充检验方法批件2009030）中的液质联用色谱条件进行定性检查并确认，阳性样品使用高效液相色谱仪外标一点法对其所含成分进行含量测定，以mg·瓶-1为计算单位。
2.2 仪器条件 2.2.1 LC-MS/MS条件色谱柱：岛津Shim-pack XR-ODS（100 mm×2.0 mm，2.2 μm）；流动相：0.1%乙酸的10 mmol·L-1乙酸铵溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~8 min，27%B；8~18 min，27%B→80%B；18~20 min，80%B）；流速：0.3 mL·min-1。质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，一级质谱全扫描的扫描范围m/z 100~1 000，二级质谱全扫描的扫描范围m/z 40~1 000；离子源参数：雾化气为高纯氮气，GS1为380 Pa，GS2为380 Pa，CUR GAS为207 Pa，离子源温度550 ℃，电喷雾电压5 500 V，去簇电压80 V，碰撞能量24 V。CDS自动校准（APCI positive calibration solution，SCIEX公司提供）。
2.2.2 HPLC条件色谱柱：岛津Inertsil ODS-SP C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温：室温；流动相：10 mmol·L-1乙酸铵溶液（A）-甲醇（B）-乙腈（C），梯度洗脱（0~15 min，10%B→25%B；15~25 min，25%B→55%B；25~35 min，55%B，保持15%C）；流速：1.0 mL·min-1；二极管阵列检测器扫描范围：200~400 nm。
2.3 样品处理方法补充检验方法批件2009030中，供试品溶液为取样品1次服用量进行提取及测定。但部分保健酒或酒类样品未明确1次服用量，且样品为乙醇溶液，无需提取制备，故对取样方法进行简化，直接进样或稀释、浓缩后进样。
2.3.1 LC-MS/MS供试品溶液制备精密量取1 mL样品于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，供定性检查。
2.3.2 HPLC供试品溶液制备将样品用0.22 μm微孔滤膜过滤，即为HPLC供试品溶液。对于含量较低的供试品，采取适当浓缩，即精密量取50 mL样品于蒸发皿中，置沸水浴中浓缩至5 mL以下，用甲醇定容至10 mL量瓶中，用0.22 μm微孔滤膜过滤，供定量检查。
3 结果 3.1 PDE-5抑制剂及其衍生物检出率及含量在64批次样品中，12批次保健酒及酒类制品中检测到PDE-5抑制剂及其衍生物，检出率为19%。所检出的成分包括西地那非、伐地那非、氨基他达拉非、羟基豪莫西地那非、丙氧基苯基艾地那非（propoxyphenyl aildenafil）、丙氧基苯基硫代艾地那非（propoxyphenyl thioaildenafil）、艾地那非、羟基硫代豪莫西地那非和一种新型艾地那非衍生物。非法添加频次较高的化合物为西地那非、伐地那非还同时存在混合添加2~3种成分的情况。在编号s-27、s-29的样品中不仅检测到补充检验方法批件2009030中的西地那非、伐地那非和羟基豪莫西地那非，还分别检测到批件中未涉及的艾地那非和羟基硫代豪莫西地那非。结果见表 2。
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表 2 非法添加PDE-5抑制剂及其衍生物检测结果 Table 2 Detection results of the illegal addition of PDE-5inhibitors and analogues |
在检测编号s-16、s-27及s-29样品时，发现有5种化合物其二级质谱碎片与已知的西地那非的二级质谱碎片具有一定的相似性，其具有m/z 99、m/z 283、m/z 299和m/z 311等西地那非的二级特征碎片（如图 1、图 2），推测这5种化合物为PDE-5抑制剂衍生物。后经查阅大量文献，并将实验所得到的紫外图谱、精确质量数、二级质谱图碎片及NMR数据同文献比较，确定其中4种为丙氧基苯基艾地那非、丙氧基苯基硫代艾地那非、艾地那非和羟基硫代豪莫西地那非[11-13]。对从s-16样品制备分离得到的新型PDE-5抑制剂衍生物，通过对其紫外图谱、红外图谱、精确质量数、二级质谱图碎片及NMR数据分析，确定其结构为嘧啶酮环上6位N上的活泼H被乙基取代的丙氧基苯基硫代艾地那非衍生物，为一种新型艾地那非衍生物，分子式为C26H38N6O4S[14]。结构如图 3。
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图 1 所检测到的5种PDE-5抑制剂衍生物的二级质谱碎片 Figure 1 MS2 spectra of 5 kinds of PDE-5 inhibitor analogues |
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图 2 西地那非裂解规律 Figure 2 MS2 fragmentation pattern of sidenafil |
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图 3 新型艾地那非衍生物的分子结构 Figure 3 Molecular structure of the new aildenafil analogue |
在此次监测中发现，批件中使用液相色谱与DAD检测器联用作为初筛，其灵敏度的局限性导致含量低的阳性样品漏检情况的发生。同时由于样品基质的干扰，导致部分样品呈现假阳性。采用液相色谱与质谱联用作为样品初筛，可避免阳性样品漏检及错检，并在发现新型添加物方面有一定优势。保健酒及酒类制品中PDE-5抑制剂及其衍生物添加种类多，此次发现的有西地那非、伐地那非、氨基他达拉非、羟基豪莫西地那非、丙氧基苯基艾地那非、丙氧基苯基硫代艾地那非、艾地那非、羟基硫代豪莫西地那非和一种新型艾地那非衍生物。
PDE-5抑制剂及其衍生物的非法添加成分从以往的单独添加西地那非、他达拉非等成分，到组合添加多种PDE-5抑制剂及其衍生物；含量差异从几十纳克到几十毫克；从添加已知成分，到添加结构修饰的新型衍生物。PDE-5抑制剂及其衍生物非法添加方法方式及组成越来越复杂，为监测工作增加了难度。
消费者以强身健体为目的，购买相关保健酒及酒类制品，却摄入不同剂量的PDE-5抑制剂其衍生物，其危害严重。产品中非法添加PDE-5抑制剂及其衍生物的添加形式多种多样，而检测方法相对滞后，因此急需相关快速高效的检测方法建立。
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