小儿退热合剂（又名小儿退热口服液），为儿科常用方剂，由大青叶、板蓝根、金银花、连翘、栀子、牡丹皮等12味中药组成，具有疏风解表及解毒利咽的功效，主要用于小儿外感风热所致的感冒，症见发热恶风、头痛目赤、咽喉肿痛；上呼吸道感染见上述证候者。该制剂标准现收载于2015年版中国药典^[1]，其含量测定主要是控制栀子苷和黄芩苷的含量，该方法由于分别采用了2套色谱系统，较费时费力。小儿退热合剂组方较为复杂，成分多样。目前关于其含量测定已有研究和报道，但多集中在测定单一成分含量^[2-6]，仅有少数报道使用单波长测定2个成分含量^[7-9]，且测定不同成分所需的色谱条件不尽相同。该制剂中的各特征成分吸收波长差异较大，仅使用单一波长无法兼顾各成分的最大吸收。为了更有效地控制该制剂的质量同时简化操作，本文建立了一种同时测定绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚4种主要成分含量的方法，为小儿退热合剂的质量控制提供了参考。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪（含四元泵、在线脱气机、自动进样器、DAD二极管阵列检测器和LC Solution工作站）；月旭材料科技上海有限公司Welch Ultimate XB-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；Millipore Milli-QA超纯水器；Elma Elmasonic S150超声波清洗器；Mettler Toledo XS205十万分之一分析天平。

绿原酸对照品（批号110753-201314，含量以96.6%计）、栀子苷对照品（批号110749-200512，供含量测定用）、黄芩苷对照品（批号：110715-201318，含量以95.2%计）、丹皮酚对照品（批号110708-200506，供含量测定用）均购于中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

样品：来自19家生产企业，共68批。

2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 混合对照品储备溶液

分别精密称取绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚的对照品适量，加50%甲醇制成各成分对照品母液（绿原酸0.170 8 mg·mL^-1、栀子苷0.409 2 mg·mL^-1、黄芩苷0.419 8 mg·mL^-1、丹皮酚0.253 8 mg·mL^-1）。精密吸取上述母液绿原酸2 mL，栀子苷6 mL，黄芩苷8 mL，丹皮酚2 mL，置20 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，即得绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚的混合对照品储备溶液（浓度分别为0.017 08 mg·mL^-1、0.122 8 mg·mL^-1、0.167 9 mg·mL^-1、0.025 38 mg·mL^-1）。

2.1.2 混合对照品溶液

精密吸取上述混合对照品储备溶液5 mL，置10 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，即得混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液

精密量取小儿退热合剂1 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）5 min，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.4 阴性样品溶液

参照中国药典2015年版小儿退热合剂项下【制法】，模拟工艺分别制备缺金银花阴性样品、缺栀子阴性样品、缺牡丹皮和白薇的阴性样品、以及缺黄芩阴性样品，并按“2.1.3”项下方法制备阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

采用月旭材料科技上海有限公司Welch Ultimate XB-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~23 min，13%A→35%A；23~33 min，35%A→60%A；33~50 min，60%A→75%A），流速1.0 mL·min^-1，检测波长为330 nm（绿原酸）、240 nm（栀子苷）、278 nm（黄芩苷和丹皮酚），柱温为30 ℃，对照品溶液进样量为10 μL，供试品溶液进样量为5~10 μL。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5 000，分离度 > 1.5。混合对照品溶液、供试品溶液与阴性样品溶液色谱图见图 1。

2.3 线性关系考察

精密吸取“2.1.1”项下混合对照品储备溶液0.2、0.5、1、2、5、10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得系列混合对照品溶液；精密吸取上述溶液10 μL，在上述色谱条件下分别进行测定，以对照品的进样量（X，μg）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表 1。

2.4 精密度试验

精密吸取同一份供试品溶液（L生产企业样品，批号20150103），连续进样6次，结果绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为0.33%、0.09%、0.32%和0.05%。

2.5 稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液（L企业样品，批号20150103），在室温下放置0、2、4、8、12、24、48 h后进样测定，结果绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为0.87%、0.59%、0.35%、1.12%，说明供试品溶液在配制好后48 h内稳定。

2.6 重复性试验

取L企业样品（批号20150103）6份，分别按“2.1.3”项下制备供试品溶液，进样10 μL进行测定，测得绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚含量的平均值分别为0.168 9、1.181 5、1.171 1、0.347 1 mg·mL^-1，RSD分别为1.77%、1.83%、1.69%、1.56%。结果表明该方法重复性较好。

2.7 加样回收试验

取已知含量（绿原酸0.168 9 mg·mL^-1、栀子苷1.181 5 mg·mL^-1、黄芩苷1.171 1 mg·mL^-1、丹皮酚0.347 1 mg·mL^-1）的小儿退热合剂样品（L企业，批号20150103）9份，平均分成3组，每组分别精密加入绿原酸母液0.4、0.5、0.6 mL，栀子苷母液1.2、1.5、1.8 mL，黄芩苷母液1.28、1.60、1.92 mL，丹皮酚母液0.56、0.70、0.84 mL，按“2.1.3”项下方法制备供试溶液，在上述色谱条件下进样10 μL分别进行测定，计算回收率，结果见表 2。

2.8 样品测定

分别精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液10 μL及供试品溶液5~10 μL，注入高效液相色谱仪，按本法及药典法^[1]的色谱条件分别进样测定，计算绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚的含量，结果见表 3及图 2。对2种方法所测定的含量值分别进行t检验，结果显示2种方法测定的栀子苷和黄芩苷的结果无显著性差异（P > 0.05）。

3 讨论 3.1 提取条件的选择

药典法规定使用水作为提取溶剂测定小儿退热合剂中栀子苷的含量，使用50%甲醇作为提取溶剂测定黄芩苷的含量。本研究同时比较了水、30%甲醇、50%甲醇对绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚的提取效率，发现50%甲醇的提取效率最高，能够兼顾以上4种待测成分。

3.2 流动相的选择

参考相关文献[10-15]，最终选用了乙腈和一定浓度的磷酸水溶液作为流动相，磷酸的加入可以使得各峰的分离度较好，且绿原酸和黄芩苷的峰形更好。文献报道小儿退热合剂的含量测定多为单一成分，采用等度洗脱，本文需测定4个成分，待测成分极性不尽相同，采用等度洗脱分离度较差，故选用了梯度洗脱的方法。

3.3 阴性样品溶液的制备

由于处方中的白薇也含有少量丹皮酚，因此本文制备了缺牡丹皮和白薇的阴性样品溶液。

3.4 耐用性考察

曾考察了Welch Ultimate XB-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C₁（4.6 mm×250 mm，5 μm）₈、Thermo HyPurity C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）3种色谱柱，发现各待测成分的分离度和理论塔板数均能达到要求。

3.5 结果分析

对19家生产企业共68批样品进行测定，绿原酸、栀子苷、黄芩苷、丹皮酚含量范围分别为0.05~0.85、0.34~4.44、0.59~4.52、0.04~1.13 mg·mL^-1。除了不同生产企业之间的差异较大，部分生产企业不同批次间的差异也较大，如K生产企业栀子苷的含量为1.64~4.44 mg·mL^-1，相差近3倍。

本文建立了HPLC-DAD法同时测定小儿退热合剂中绿原酸、栀子苷、黄芩苷和丹皮酚的含量，保证各成分在最大吸收波长处检测，且仅使用1个色谱系统即可实现多个指标成分的质量控制。其中栀子苷和黄芩苷的测定结果与中国药典2015年版方法比较，无显著性差异。19家生产企业的68批样品的检测数据，可为临床用药的安全、有效提供基础研究资料。