榄香烯（elemene）系我国首先从姜科植物温莪术中提取的具有抗癌活性的倍半萜烯天然抗癌药物。以β-榄香烯为主要成分的榄香烯乳注射液是我国自主研发成功的二类抗肿瘤新药，目前在临床上广泛用于恶性浆膜腔积液、肺癌、消化道肿瘤、脑瘤以及其他浅表性肿瘤的治疗^[1-3]。榄香烯的含量测定主要以GC法和GC-MS联用的方法为主^[4-8]，也有报道采用LC法^[9-14]。但是，榄香烯有关物质的检查方法文献报道较少，主要为RP-HPLC法^[13]，国外药典和中国药典均未收载本品，国家药品标准WS₁-（X-094）-2000Z收载了榄香烯^[15]原料药的有关物质检查，方法与含量测定方法一致，为填充柱法。据厂家研究资料，榄香烯是以莪术油为原料，通过精馏分离得到，终产品必定为沸点和极性十分相近的化合物的混合物，除β-、γ-、δ-榄香烯（分子式同为C₁₅H₂₄）确定为有效成分外，其他为未知杂质，大多又为β-榄香烯的同分异构体。应用原方法测定时，β-榄香烯与其他2个组分及其他挥发性组分不能得以较好分离，影响有关物质检测的准确性。采用毛细管气相色谱法（CGC法）则能较大地提高各组分之间的分离度，提高有关物质检测的准确性。在所查阅的研究文献中，尚未有人确证其中的未知杂质，作者采用GC-MS的方法确证了其中一个含量最大（约为8%）的杂质为β-石竹烯（分子式为C₁₅H₂₄）。本文采用CGC法并辅以GC-MS的方法，对榄香烯原料的有关物质进行了检测，方法简便，准确度高，适合于榄香烯有关物质的检测。

1 仪器与试药

Agilent 7890A气相色谱仪，GC-MS2010气相色谱-质谱联用仪，METTLER TOLEDO MT5百万分之一天平。

对照品β-榄香烯（中国食品药品检定研究院，批号100268-200401，含量99.2%）；γ-榄香烯（大连远大制药有限公司提供，批号20081009，含量70.39%）；δ-榄香烯（大连远大制药有限公司提供，批号20081009，含量77.79%）；β-石竹烯[TCI（上海）化成工业发展有限公司，批号C0796，含量 > 90.0%（GC）]。丙酮为色谱纯。榄香烯原料药，大连华立德泽药业有限公司提供，批号分别为1011211、1012031、1012121。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

采用安捷伦DB-WAXetr毛细管柱（60 m×0.32 mm× 0.25 μm），PEG-20M为固定液，柱温为程序升温（起始柱温为80 ℃，维持5 min，以3 ℃·min^-1的速率升温至185 ℃，再以20 ℃·min^-1的速率升温至230 ℃，维持60 min），进样口温度230 ℃，检测器温度230 ℃，分流比10:1，柱前恒压124.11 kPa，进样量1.0 μL。

2.2 色谱系统适用性试验

取β-榄香烯对照品和β-石竹烯各适量，用丙酮制成每1 mL中含β-榄香烯1 mg和β-石竹烯0.08 mg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液。按上述色谱条件试验，β-榄香烯峰与β-石竹烯峰之间的分离度应符合规定，理论板数按β-榄香烯峰计算应不低于200 000。实测结果显示，两峰之间的分离度为2.0，β-榄香烯峰的理论板数为391 145。系统适用性色谱图见图 1。

2.3 方法专属性试验 2.3.1 未破坏样品试验

取本品约10 mg，置10 mL刻度试管中，加丙酮定容至刻度，摇匀，进样，记录色谱图，见图 2-A。

2.3.2 酸破坏试验

称取本品约10 mg，置10 mL刻度试管中，加0.5 mL丙酮，再加入1 mol·L^-1盐酸溶液0.5 mL，混匀，放置1 h，加入0.5 mL的1 mol·L^-1氢氧化钠溶液中和，振摇，再加丙酮至刻度，摇匀，以4 000 r·min^-1离心10 min，取上清液进样，记录色谱图，见图 2-B。

2.3.3 碱破坏试验

称取本品约10 mg，置10 mL刻度试管中，加丙酮0.5 mL，再加入1 mol·L^-1氢氧化钠溶液0.5 mL，混匀，放置1 h，加入1 mol·L^-1盐酸溶液0.5 mL中和，振摇，再加丙酮至刻度，摇匀，以4 000 r·min^-1离心10 min，取上清液进样，记录色谱图，见图 2-C。

2.3.4 氧化破坏试验

称取本品约10 mg，置10 mL刻度试管中，加0.5 mL丙酮，再加入30%过氧化氢溶液0.5 mL，混匀，放置1 h，再加丙酮至刻度，摇匀，进样，记录色谱图，见图 2-D。

2.3.5 加热破坏试验

称取本品约10 mg，置10 mL刻度试管中，密塞，在60 ℃水浴中加热1 h，取出放冷，加丙酮定容至刻度，摇匀，进样，记录色谱图，见图 2-E。

2.3.6 光照破坏试验

取本品适量，置石英比色杯中，密塞，先在紫外灯（254 nm）下照射1 h，再在紫外灯（366 nm）下照射1 h，称取照射后的样品约10 mg，置10 mL刻度试管中，加丙酮定容至刻度，摇匀，进样，记录色谱图，见图 2-F。

比对空白溶剂和未破坏的样品色谱图可以发现，榄香烯原料药仅在碱破坏试验条件下降解或转化较多，其他试验条件下均显示较好的稳定性，所确定的色谱系统对所产生的杂质均能较好地分离。

2.4 线性试验

精密称取β-榄香烯对照品50.440 mg，置250 mL量瓶中，用丙酮定容至刻度，摇匀，即得对照品储备液；精密量取储备液各适量，分别置适宜的量瓶中，用丙酮制成每1 mL中含β-榄香烯5.003 6、10.007、20.015、40.029、80.058、120.09与160.12 μg的溶液，作为系列线性试验用对照品溶液，依法检测，记录色谱图，以峰面积A为纵坐标，质量浓度C为横坐标，得线性方程：

A=0.522 3C-0.090 13  r=1.000（n=7）

β-榄香烯质量浓度在5.003 6~160.12 μg·mL^-1范围内线性良好。

2.5 进样精密度试验

取“2.4”项下质量浓度为40.029 μg·mL^-1的线性试验用对照品溶液连续进样6次，记录峰面积，RSD=0.73%，表明进样精密度良好。

2.6 定量限与检出限试验

精密量取“2.4”项下质量浓度为20.015 μg·mL^-1的线性试验用对照品溶液3 mL，置20 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，即得定量限试验用溶液，进样，记录色谱图；以S/N=10计算，β-榄香烯的定量限为2.68 μg·mL^-1。精密量取“2.4”项下质量浓度为20.015 μg·mL^-1的线性试验用对照品溶液1 mL，置20 mL量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，即得检出限试验溶液，依法检测，记录色谱图；以S/N=3计算，β-榄香烯的检出限为0.87 μg·mL^-1。

2.7 溶液稳定性

供试品溶液在室温下放置，于0、33、58 h进样，记录峰面积，计算RSD，结果见表 1。结果表明，供试品溶液在58 h内稳定，杂质无明显变化。

2.8 有关物质检测

精密称取本品适量，加丙酮制成每1 mL中约含1 mg的溶液，作为供试品溶液；取β-榄香烯对照品适量，精密称定，加丙酮制成每1 mL中含0.15 mg的溶液，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液1.0 μL，注入气相色谱仪，调节检测灵敏度，使对照品溶液主峰的峰高约为满量程的20%；再精密量取供试品溶液、对照品溶液各1.0 μL，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。在供试品溶液的色谱图中，除空白溶剂峰和β-榄香烯峰、δ-榄香烯峰（相对保留时间约0.75）、γ-榄香烯峰（相对保留时间约1.10）外，如有杂质峰，按外标法以各杂质峰面积的和计算，不得过15.0%。批号分别为1011211、1012031、1012121的3批样品中有关物质总量依次为15.4%、15.5%、14.7%；供试品溶液的色谱图及其局部放大图见图 3。

3 讨论 3.1 有关物质的限度

榄香烯原料药标准WS₁-（X-094）-2000Z收载的有关物质检查与含量测定方法一致，为填充柱法，按照填充柱法进行检测，除了检测到β-榄香烯之外，还可以检测到γ-榄香烯和δ-榄香烯，检测到其他杂质峰较少（见图 4）。受柱效的影响，分离出的杂质量非常有限，杂质限度订为不超过8.0%很容易达到，但是无法反映产品的真实质量。采用CGC毛细管柱法，对杂质的分离远优于填充柱法，测得样品的杂质量均大大超出原标准的限度（8.0%）。在含量限度（85.0%）不变的情况下，考虑质量守恒的要求，杂质限度修订为杂质总量不超过15.0%。

3.2 色谱柱的选择及程序升温条件的优化

试验时选取了4根不同的色谱柱[DB-WAXetr（60 m×0.32 mm×0.25 μm）、DB-WAXetr（30 m×0.32 mm×1.0 μm）、DB-WAXetr（30 m×0.25 mm×0.5 μm）、HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm）]进行试验，并调整GC的程序升温条件。除HP-5色谱柱基本不能将β-石竹烯与β-榄香烯分离以及DB-WAXetr（30 m×0.32 mm×1.0 μm）的分离度不能达到要求外，其他2条色谱柱均适用，尤其以DB-WAXetr（60 m×0.32 mm×0.25 μm）色谱柱分离效果最好，各色谱柱的分离效果见表 2。

3.3 系统适用性试验要求的确定

在试验的过程中，采用优化后的色谱系统对本品进行分离，发现在β-榄香烯峰之后有1个较大的未知色谱峰与β-榄香烯峰较难分离，通过检索质谱库并采用对照品比较分析的方法确认，该杂质峰应为β-石竹烯峰，且其峰面积约为β-榄香烯峰面积的8%左右。故配制β-榄香烯和β-石竹烯的混合对照品溶液作为系统适用性试验溶液，规定两者之间的分离度应符合规定，β-榄香烯的理论板数应不低于200 000。

3.4 有关物质计算方法

榄香烯以莪术油为原料，通过精馏分离得到。据厂家研究资料和GC-MS数据显示，除β-、γ-、δ-榄香烯（分子式同为C₁₅H₂₄）确定为有效成分外，能够确证的杂质为β-石竹烯（分子式为C₁₅H₂₄），其他为未知杂质，大多又为β-榄香烯的同分异构体，在FID检测器中的响应基本相同。本品中β-、γ-、δ-榄香烯的含量之和约为85%，不宜采用主成分自身对照法计算，故采用β-榄香烯对照品用外标法计算有关物质的含量。

3.5 其他探索性研究

由供试品溶液的色谱图（图 3）可知，在β-榄香烯峰之前有2个大小差不多的较大未知杂质峰，本文曾采用GC-MS的方法试图搞清楚其为何化合物，经检索质谱库发现，保留时间为21.659 min的未知杂质的相对分子质量为204，参考物质为（1α，4aα，8aα）-1，2，3，4，4a，5，6，8a-octahydro-7-methyl-4-methylene-1-（1-methylethyl）-naphthalene，相似度为88%。保留时间为21.880 min的未知杂质的相对分子质量为204，参考物质为β-榄香烯，相似度为94%。显然，它们均为β-榄香烯的同分异构体，要进一步确证其结构信息，必须获得一定量高纯度的单体，在目前的实验条件下，实现的难度较大，留待今后实验条件具备的时候做进一步研究。