2017, Vol. 37 
聚山梨酯（polysorbate），又叫吐温（Tween），其化学名称为聚氧乙烯20山梨醇酐。聚山梨酯类化合物为非离子型表面活性剂，为一系列聚氧乙烯去水山梨醇的部分脂肪酸酯。聚山梨酯类化合物是药物制剂中常用的辅料之一，经常被用作乳化剂、非离子表面活性剂、增溶剂、润湿剂、分散/助悬剂等[1-2]。聚山梨酯类化合物由山梨（糖）醇通过三步反应制得。首先，山梨醇脱水形成去水山梨糖；去水山梨糖同脂肪酸如油酸（生成聚山梨酯80）、硬脂酸（生成聚山梨酯60）、棕榈酸（生成聚山梨酯40）、月桂酸（生成聚山梨酯20）生成己糖酯；最后在催化剂作用下和环氧乙烷反应生成聚山梨酯类化合物。
目前聚山梨酯类化合物应用最为广泛的是聚山梨酯80（其化学名称为聚氧乙烯20山梨醇酐单油酸酯）。国内有多种药物的注射剂中使用聚山梨酯80作为助溶剂。聚山梨酯80可以用于人体静脉注射，但在注射剂的临床应用中，仍可见一些安全性问题的报道，如过敏、溶血等不良反应[3-8]，在动物的药理毒理试验中也发现聚山梨酯80可能对心血管等系统有一定的影响。研究表明，静脉注射含有聚山梨酯80注射剂产生的副作用可能跟聚山梨酯80质量不高有关。目前，定性研究聚山梨酯80中的各组分及其含量的方法主要有紫外分光光度法法（UV）[9]、高效液相色谱法（HPLC）[10-12]、高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用法[13]和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）法[14-15]等。但是目前使用的仪器方法无法有效定性鉴别聚山梨酯80与其他聚山梨酯产品（如聚山梨酯20，如聚山梨酯40，如聚山梨酯60）。并且，聚山梨酯80里面含有聚氧乙烯山梨醇酐一油酸脂、聚氧乙烯山梨醇酐二油酸脂、聚氧乙烯异山梨醇酐一油酸脂、聚氧乙烯异山梨醇酐二油酸脂、聚乙二醇一油酸酯等，由于各组分理化性质差别不是很大，用液相色谱法、紫外分光光度法等不能很好地分离，无法定量分析聚山梨酯80中各组分。目前的研究表明MALDI-TOF-MS法可以定性鉴别聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60，但是不能鉴别聚山梨酯80[15]。
核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）是20世纪40年代发展起来的一项新的分析技术，现已成为分析生物大分子、聚合物等复杂体系最强有力的方法之一。目前USP、EP和中国药典都已收载了核磁共振分析方法并得到广泛应用。例如，USP 37中采用核磁共振定量方法测定亚硝酸戊酯的含量以及奥芬得林的间/对位比例。中国药典2015年版四部中收录了核磁共振定量方法测定药用辅料泊洛沙姆188中聚氧乙烯的含量。本文通过对国内外一些厂家的聚山梨酯类化合物样品进行了MALDI-TOF-MS和核磁共振一维氢谱、碳谱分析研究，并对其中聚山梨酯类化合物核磁共振和MALDI-TOF-MS谱图进行详细的比较研究，完成市售聚山梨酯80质量进行摸底考察，为核磁共振和MALDI-TOF-MS法应用于聚山梨酯类化合物质量提升打下先期基础。
1 仪器及试药Bruker公司Ascend-500核磁共振仪；岛津公司AXIMA performance MALDI-TOF-MS仪；Milli-Q的纯水仪。试剂氘代甲醇、重水、α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质、甲醇购自SIGMA-Aldrich；聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80购自SIGMA，其他5种聚山梨酯80购自国内外不同厂家；油酸对照品购自中国食品药品检定研究院，具体信息见表 1。
|
表 1 聚山梨酯类化合物样品信息 Table 1 The sample information of polysorbates |
一维13C-NMR实验是在装配5 mm BBO探头的Bruker Ascend-500核磁共振谱仪上采集。采样时间（AQ）1.1 s，弛豫时间（D1）1 s，测量温度（T）25 ℃，谱宽（SW）δC 236.6，采样点数64 k，扫描次数（NS）32 768次，线展宽因子0.3 Hz。
一维1H-NMR实验是在装配5 mm BBO探头的Bruker Ascend-500核磁共振谱仪上采集。采样时间（AQ）4.38 s，弛豫时间（D1）2 s，测量温度（T）25 ℃，谱宽（SW）δH 15，采样点数64 k，扫描次数（NS）128次，线展宽因子0.3 Hz。
MALDI-TOF-MS实验是在岛津AXIMA performance飞行质谱仪上采集。采样基质是α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA），采样质量范围是m/z 500~4 000，采样激光能量是60~90，采样点数169。
3 供试品溶液配制及测定 3.1 核磁共振法称取聚山梨酯样品约60 mg，加入氘代甲醇0.6 mL，使其完全溶解，即得供试品溶液；将供试品溶液转移到5 mm核磁管中，按“3”项参数进行分析。
3.2 MALDI-TOF-MS法称取聚山梨酯样品约50 mg，加入甲醇1 mL，使其完全溶解，然后取溶液100 μL，用甲醇稀释到1 mL，最终配成质量浓度约为5 mg·mL-1的溶液。上述配好的样品溶液与α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质的乙腈溶液（质量浓度5 mg·mL-1）以及5 mg·mL-1氯化钠盐水溶液1:1:1混匀，即得供试品溶液；取供试品溶液1 mL点样，晾干后按“3”项参数进行分析。
4 结果与讨论 4.1 聚山梨酯MALDI-TOF-MS法定性鉴别MALDI-TOF-MS法是目前定性分析聚合物的有效技术之一，聚合物的特征性质谱峰可以有效地定性鉴别聚合物中各个组分。在本研究中，结合4种聚山梨酯类化合物的理论分子式/相对分子质量（表 2），对系列聚山梨酯类化合物进行了初步的MALDI-TOF-MS方法研究。图 1为4种聚山梨酯类化合物MALDI-TOF质谱局部放大图。利用4种聚山梨酯类化合物分子式和相对分子质量的理论计算值对其进行详细归属。发现所有聚山梨酯类化合物的未酯化产物的特征质谱峰为m/z 1 508.0。聚山梨酯20的特征质谱峰m/z 1 514.0是聚山梨酯20的钠峰；聚山梨酯40的特征质谱峰m/z 1 526.1是聚山梨酯40的钠峰；聚山梨酯60的特征质谱峰m/z 1 510.0是聚山梨酯60的钠峰；聚山梨酯80的特征质谱峰m/z 1 508.0是聚山梨酯80的钠峰。通过4种聚山梨酯类化合物质谱峰归属可知，聚山梨酯80的特征质谱峰与所有聚山梨酯类化合物的未酯化产物的特征质谱峰一致，在其他聚山梨酯类化合物质谱图中都有出现，表明质谱方法目前还不能区分聚山梨酯80和其他聚山梨酯类化合物，需要其他方法区分聚山梨酯80和其他聚山梨酯类化合物。
|
|
表 2 4种聚山梨酯类化合物理论分子式/相对分子质量计算表 Table 2 The molecular formula/relative molecular mass of four polysorbates |
|
1.聚山梨酯20（polysorbate 20）2.聚山梨酯40（polysorbate 40）3.聚山梨酯60（polysorbate 60）4.聚山梨酯80（polysorbate 80） *标示为特征质谱峰 图 1 4种聚山梨酯类化合物MALDI-TOF-MS的全图（A）和局部放大说明图（B） Figure 1 Full(A)and expanded(B)MALDI-TOF-MS spectra of four polysorbates |
用相同的核磁共振参数分别采集油酸和4种聚山梨酯类化合物一维1H和13C-NMR谱，图 2为油酸和4种聚山梨酯类化合物核磁共振1H谱。通过图 2比较发现，聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80核磁共振1H谱基本一致，尤其是聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60。但是聚山梨酯80与其他3种聚山梨酯类化合物相比，在化学位移δH 2.1和δH 5.3处有特征峰，其他聚山梨酯类化合物没有峰。由于聚山梨酯80为油酸酯，油酸含有1个不饱和双键，δH 5.3处特征峰为不饱和双键氢，δH 2.1处特征峰为不饱和双键相邻CH2，通过油酸上特有的不饱和双键附近氢的信号，就可以对聚山梨酯80定性区分。如果出现在其他聚山梨酯类化合物（聚山梨酯20、40、60）中添加油酸的情况，则可以通过中国药典相关项下的游离酸检测控制非法添加。上述研究表明，核磁共振1H谱可以简单明确地并专属性地区别聚山梨酯80与其他聚山梨酯类化合物。
|
1.油酸（oleic acid2.聚山梨酯80（polysorbate 80）3.聚山梨酯20（polysorbate 20）4.聚山梨酯40（polysorbate 40）5.聚山梨酯60（polysorbate 60） 图 2 油酸以及4种聚山梨酯类化合物核磁共振1H谱 Figure 2 1H-NMR of oleic acid and four polysorbates |
图 3为油酸以及4种聚山梨酯类化合物核磁共振13C谱。聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80核磁共振13C谱基本一致。聚山梨酯80与聚山梨酯20、40、60相比，聚山梨酯80在化学位移δC 130附近有特征峰，其他聚山梨酯类化合物没有峰。化学位移δC 130处是油酸不饱和双键碳信号峰，这进一步表明核磁共振13C谱可以区别聚山梨酯80与其他聚山梨酯类化合物。其他聚山梨酯类化合物有可能通过添加油酸来影响定性检验结果，但可结合中国药典中游离酸的测定（酸值）来避免添加的发生。
|
1.油酸（oleic acid）2.聚山梨酯80（polysorbate 80）3.聚山梨酯20（polysorbate 20）4.聚山梨酯40（polysorbate 40）5.聚山梨酯60（polysorbate 60） 图 3 油酸以及4种聚山梨酯类化合物核磁共振13C谱 Figure 3 13C-NMR of oleic acid and four polysorbates |
用相同的核磁共振参数分别采集6种不同厂家（表 1）的聚山梨酯80 1H-NMR谱（图 4）。通过比较不同厂家聚山梨酯80核磁共振1H谱发现，6个样品1H谱基本一致，只有在化学位移δH 5~6.5之间有些不同（图 5）。化学位移δH 5~6.5的峰归属是油酸中不饱和双键氢的信号峰（标记为‘*’），图 5说明有些厂家的聚山梨酯80里油酸双键氢位置不确定，这说明有些厂家合成聚山梨酯80的油酸原料不纯，质量控制体系和方法不完善。
|
1.样品1（sample 1）2.样品2（sample 2）3.样品3（sample 3）4.样品4（sample 4）5.样品5（sample 5）6.样品6（sample 6） 图 4 聚山梨酯80核磁共振1H谱 Figure 4 1H-NMR of polysorbate 80 |
|
1.样品1（sample 1）2.样品2（sample 2）3.样品3（sample 3）4.样品4（sample 4）5.样品5（sample 5）6.样品6（sample 6） 图 5 聚山梨酯80核磁共振1H谱局部放大图 Figure 5 Expanded 1H-NMR spectra of polysorbate 80 |
用相同的核磁共振参数分别采集6种不同厂家的聚山梨酯80 13C-NMR谱（图 6）。比较不同厂家聚山梨酯80核磁共振13C谱，发现6个样品13C谱基本一致，只有在化学位移δc 120~150之间有些不同（图 7）。核磁共振13C谱化学位移δc 120~150之间是双键碳的信号峰，图 7研究发现有些厂家的聚山梨酯80在化学位移δc 120~150之间出现多个双键碳信号峰（标记为‘*’），这是油酸中双键位置移动造成的，进一步说明有些厂家合成聚山梨酯80的油酸不纯，质量控制体系和方法不完善。
|
1.样品1（sample 1）2.样品2（sample 2）3.样品3（sample 3）4.样品4（sample 4）5.样品5（sample 5）6.样品6（sample 6） 图 6 聚山梨酯80核磁共振13C谱 Figure 6 13C-NMR of polysorbate 80 |
|
1.样品1（sample 1）2.样品2（sample 2）3.样品3（sample 3）4.样品4（sample 4）5.样品5（sample 5）6.样品6（sample 6） 图 7 聚山梨酯80核磁共振13C谱局部放大图 Figure 7 Expanded 13C-NMR spectra of polysorbate 80 |
目前鉴别聚山梨酯80与其他聚山梨酯类化合物方法不多，例如中国药典理化鉴定方法，但是中国药典理化鉴定方法专属性不够，不能有效地鉴别聚山梨酯80与其他聚山梨酯类化合物。本文利用MALDI-TOF-MS质谱图中的特征离子峰有效鉴别聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60，并且在鉴定过程发现吐温确实是组分复杂的聚合物。MALDI-TOF-MS技术不能区分聚山梨酯80和其他聚山梨酯类化合物，但是聚山梨酯80的1H-NMR、13C-NMR谱中有特征性双键信号峰，可专属性地与其他聚山梨酯类化合物区分。本文还研究不同厂家之间聚山梨酯80，研究发现许多厂家聚山梨酯80的1H-NMR，13C-NMR谱中双键信号峰有很多杂峰，这是油酸中双键位置异构化造成的，可能是由于这些厂家在合成聚山梨酯80过程中使用的油酸原料不纯，质量控制体系和方法不完善。本文的研究成果表明MALDI-TOF-MS法和核磁共振1H谱、13C谱的结合使用可有效地、专属性强地定性鉴别聚山梨酯类化合物，为聚山梨酯类化合物质量提升打下先期基础。
| [1] |
Huot E, Barrena-Gonzalez C, Petitdemange H. Tween 80 effect on bacteriocin synthesis by Lactococcus lactis subsp.cremoris J46[J]. Lett Appl Microbiol, 1996, 22(4): 307. DOI:10.1111/j.1472-765X.1996.tb01167.x |
| [2] |
Silvestre MP, Chaiyasit W, Brannan RG, et al. Ability of surfactant headgroup size to alter lipid and antioxidant oxidation in oil-in-water emulsions[J]. J agric Food Chem, 2000, 48(6): 2057. DOI:10.1021/jf991162l |
| [3] |
Masini E, Planchenault J, Pezziardi F, et al. Histamine-releasing properties of polysorbate 80 in vitro and in vivo:correlation with its hypotensive action in the dog[J]. Agents Actions, 1985, 16(6): 470. DOI:10.1007/BF01983649 |
| [4] |
Gough WB, Zeiler RH, Barreca P, et al. Hypotensive action of commercial intravenous amiodarone and polysorbate 80 in dogs[J]. J Cardiov Pharmacol, 1982, 4(3): 375. DOI:10.1097/00005344-198205000-00006 |
| [5] |
Cheung WK, Natarajan J, Sanders M, et al. Comparative pharmacokinetics, safety, and tolerability after subcutaneous administration of recombinant human erythropoietin formulated with different stabilizers[J]. Biopharm Drug Dispos, 2000, 21(6): 211. DOI:10.1002/(ISSN)1099-081X |
| [6] |
Badiu I, Geuna M, Heffler E, et al. Hypersensitivity reaction to human papillomavirus vaccine due to polysorbate 80[J]. BMJ Case Rep, 2012, 2012: pii:bcr0220125797. DOI:10.1136/bcr.02.2012.5797 |
| [7] |
Steele RH, Limaye S, Cleland B, et al. Hypersensitivity reactions to the polysorbate contained in recombinant erythropoietin and darbepoietin[J]. Nephrology(Carlton), 2005, 10(3): 317. |
| [8] |
Shelley WB, Talanin N, Shelley ED. Polysorbate 80 hypersensitivity[J]. Lancet, 1995, 345(8960): 1312. DOI:10.1016/S0140-6736(95)90963-X |
| [9] |
Wuelfing WP, Kosuda K, Templeton AC, et al. Polysorbate 80 UV/vis spectral and chromatographic characteristics-defining boundary conditions for use of the surfactant in dissolution analysis[J]. J Pharm Biomed Anal, 2006, 41(3): 774. DOI:10.1016/j.jpba.2006.01.020 |
| [10] |
Abrar S, Trathnigg B. Analysis of polyethyleneoxide macromonomers by liquid chromatography along the critical adsorption line[J]. Anal Bioanal Chem, 2011, 400(8): 2577. DOI:10.1007/s00216-010-4554-2 |
| [11] |
Abrar S, Trathnigg B. Separation of polysorbates by liquid chromatography on a HILIC column and identification of peaks by MALDI-TOF MS[J]. Anal Bioanal Chem, 2011, 400(7): 2119. DOI:10.1007/s00216-011-4933-3 |
| [12] |
Abrar S, Trathnigg B. Characterization of polyoxyethylenes according to the number of hydroxy end groups by hydrophilic interaction chromatography at critical conditions for polyethylene glycol[J]. Anal Bioanal Chem, 2011, 400(8): 2531. DOI:10.1007/s00216-010-4448-3 |
| [13] |
Vu Dang H, Gray AI, Watson D, et al. Composition analysis of two batches of polysorbate 60 using MS and NMR techniques[J]. J Pharm Biomed Anal, 2006, 40(5): 1155. DOI:10.1016/j.jpba.2005.10.007 |
| [14] |
Frison-Norrie S, Sporns P. Investigating the molecular heterogeneity of polysorbate emulsifiers by MALDI-TOF MS[J]. J Agric Food Chem, 2001, 49(7): 3335. DOI:10.1021/jf010096w |
| [15] |
Zhang Q, Meng Y, Yang H, et al. Quantitative analysis of polysorbates 20 and 40 by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2013, 27(24): 2777. DOI:10.1002/rcm.6743 |