喹诺酮类药物因其抗菌谱广，抗菌力强，作用迅速，毒副作用小，价格低廉等特点，被广泛应用于畜禽和水产养殖业，也用于饲料添加剂，以提高饲料利用率，促进动物生长，防治动物的细菌性疾病^[1]。奶牛在生长过程中长期食用含喹诺酮类药物饲料及用喹诺酮类药物治疗，药物会在奶牛体内富集，从而转移至牛奶及制品中，该类药物的过量或不当使用会导致细菌耐药性和潜在致癌性，给老百姓的健康带来巨大隐患^[2]，故其残留问题已引起广泛关注。国际食品法典委员会（CAC）和欧盟均对牛奶中恩诺沙星和环丙沙星的最高残留量作了规定^[3-4]，我国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》对液态奶中恩诺沙星和环丙沙星的最高限量做出明确的规定^[5]。因此，液态奶中恩诺沙星和环丙沙星的痕量残留快速检测分析方法的建立非常必要。

目前，喹诺酮类药物的分析方法主要有高效液相色谱法^[6-8]、高效液相色谱-串联质谱法^[9-12]、化学发光法^[13]等。其中使用最为广泛的主要是高效液相色谱法，而样品预富集是制约色谱检测的瓶颈。传统的液-液萃取前处理技术，需消耗大量有机溶剂，对环境产生污染。液相微萃取是在液-液萃取的基础上发展起来的一种前处理技术，具有消耗试剂少、简单、廉价等优点，富集倍数高，有效地解决了样品富集瓶颈问题^[14-15]。

离子液体作为一种新型绿色溶剂，具有无毒、低挥发和粘度大等优点，现已广泛应用^[16-17]。本研究拟采用离子液体分散液相微萃取（DLLME）前处理技术，结合高效液相色谱测定液态奶中恩诺沙星、环丙沙星，该方法具有操作简单，成本低廉，环境友好和富集效率高等优点。

1 仪器与试剂

e2695型高效液相色谱仪（Waters公司），配有Waters公司荧光检测器（FLD）；250 μL内插管（Waters公司）；SK8200H型超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司）；Z36HK型高速冷冻离心机（HERMIE公司）；VORTEX-2型涡旋仪（SI DIGITAL），ML204电子分析天平（梅特勒-托利多）；PE-20型pH计（梅特勒-托利多）；0.45 μm微孔滤膜（天津博纳艾杰尔）。

咪唑类离子液体：1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[（OMIM）PF₆]，阿拉丁试剂（中国）有限公司，纯度95%；1-己基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐[（HMIM）OTF]，阿拉丁试剂（中国）有限公司，纯度95%。对照品：恩诺沙星和环丙沙星纯度均高于95%，Sigma公司，于4 ℃下冷藏保存。

甲醇、乙醇、乙腈、丙酮均为色谱纯，冰乙酸、磷酸为分析纯，氯化钠分析纯（使用前于650 ℃灼烧4 h），四丁基溴化铵为优级纯，氢氧化钠为优级纯，实验所用水为娃哈哈纯净水。

实验所用的液态奶（批号20151017 B4、20151024 D1）从超市购买。

2 溶液制备 2.1 11 mmol·L^-1的四丁基溴化铵溶液

称取四丁基溴化铵3.46 g，溶于去离子水中，定容至1 000 mL，用冰乙酸调pH至3.2，得pH=3.2的11 mmol·L^-1四丁基溴化铵溶液，过0.45 μm微孔滤膜备用。

2.2 混合对照品溶液

精密称取恩诺沙星、环丙沙星的对照品各50 mg，置于50 mL量瓶中，用0.03 mol·L^-1氢氧化钠溶液溶解并稀释至刻度，即得环丙沙星、恩诺沙星质量浓度均为1 g·L^-1的混合对照品储备液；精密量混合对照品储备液1.0 mL，置于100 mL量瓶中，用流动相[11 mmol·L^-1的四丁基溴化铵溶液-乙腈（95:5）]稀释至刻度，即得环丙沙星、恩诺沙星质量浓度均为10 mg·L^-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液

准确量取液态奶样品4.00 mL，置于25 mL的聚四氟乙烯离心管中，加入氯化钠10.2 g，乙腈1 mL，用0.1 mol·L^-1磷酸溶液调节pH为4~5，涡旋振荡5 min，10 000 r·min^-1条件下离心10 min，将上清液转移至另一支聚四氟乙烯离心管中，重复离心3次，向上清液中加入萃取剂[（OMIM）PF₆]100 μL，加入质量分数为6%氯化钠溶液，调节溶液pH为3.2，涡旋震动3 min，将离心管置于高速冷冻离心机中，室温10 000 r·min^-1离心3 min，将离心管取出后，用微量进样器取底层溶液20 μL，置于250 μL内插管中，用流动相稀释至200 μL，即得供试品溶液。

3 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5 C₁₈（5 μm，150 mm×4.6 mm）；流速：1.0 mL· min^-1；流动相：11 mmol·L^-1的四丁基溴化铵溶液-乙腈（95:5），用冰乙酸调pH为3.2；激发波长：280 nm；发射波长：450 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

在上述条件下恩诺沙星、环丙沙星混合对照品溶液高效液相色谱图见图 1。

4 离子液体分散液相微萃取制备样品条件优化 4.1 萃取剂种类和体积的选择

合适的萃取剂是提高分析灵敏度的关键。实验考察了[（OMIM）PF₆]和[（HMIM）OTF]咪唑类离子液体对2种喹诺酮类药物萃取效率的影响。结果表明，[（OMIM）PF₆]对恩诺沙星、环丙沙星有更好的萃取效率，且干扰小，故本文选择[（OMIM）PF₆]为萃取剂。

随着[（OMIM）PF₆]量的增加，萃取回收率不断增加。实验考察了20、40、60、80、100、120、140 μL不同用量，结果当加入100 μL的[（OMIM）PF₆]时，萃取回收率达到最大值并趋于稳定，见图 2，这是因为体积达到100 μL时，离子液体液-相微萃取已经达到平衡，萃取剂体积越大，萃取效果越差。故本实验选择萃取剂最佳量为100 μL。

4.2 涡旋时间对萃取的影响

萃取平衡的建立需要一定时间，涡旋的目的是使离子液体分散成小液滴，增大了其与目标物溶液的接触面积，使得离子液体更迅速并充分地与样品中目标物接触，从而达到萃取平衡。实验考察了涡旋时间1~5 min对萃取结果的影响，在前3 min随着时间的增长萃取效率提高，但3 min后萃取效率反而有所下降。故本实验选择的涡旋萃取时间为3 min。

4.3 盐浓度的选择

在保持其他实验条件不变的情况下，考察氯化钠的量对萃取结果的影响。盐的加入可以增大水相的离子强度，降低目标化合物在水相的溶解度，进而提高目标化合物在离子液体的萃取效率。考察了氯化钠质量分数为4%~12%时对萃取效率的影响。结果表明，随着盐用量的增加，萃取效率增大，当盐质量分数为6%时，萃取效率最佳（见图 3）。故本试验选择盐质量分数为6%。

4.4 pH的选择

pH可以影响物质的稳定性及存在形式，故pH是影响液相萃取的另一主要因素。由于恩诺沙星、环丙沙星在酸性条件下稳定性较好，本实验考察了pH为2~4范围对萃取结果的影响，结果见图 4。

5 方法的评价 5.1 线性关系和检出限、定量限及重现性

在最佳的实验条件下，从加标液态奶样品中萃取恩诺沙星、环丙沙星进行HPLC测定，分别用阴性液态奶样品配制质量浓度为5、10、20、50、100 μg·L^-1的标准样品，按“2.3”项下的方法操作，制备供试溶液。考察方法的线性范围、相关系数、检出限、定量限、重现性，分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算检出限（LOD）和定量限（LOQ），结果见表 1。

5.2 回收率和精密度

使用阴性液态奶样品分别配制5、10、20 μg·L^-1恩诺沙星、环丙沙星的标准样品，按“2.3”项下的方法操作，制备供试溶液。考察三水平下药物加标回收试验，评价方法的准确度和精密性。日内精密度是在1 d内平行分析6次标准样品所得回收率的RSD，日间精密度是通过每天分析标准样品，连续分析3 d所得回收率的RSD，由表 2可知，恩诺沙星、环丙沙星加标回收率在83.9%~98.8%，日内及日间精密度均低于12.1%。

6 与其他方法比较

本文建立的方法与公开发表的HPLC-MS^[18]、HPLC-UV^[19]、HPLC-FLD ^[20]方法进行了比较，具体见表 3。通过比较DLLME-HPLC-FLD方法的线性范围、回收率、检出限与HPLC-MS结果相当，说明DLLME-HPLC-FLD具有高的灵敏度和低的检出限，且DLLME-HPLC-FLD在样品前处理用了很少量的试剂，操作简便。

7 样品分析

取市售液态奶样品，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，在“3”色谱条件下进行测定，以外标法计算样品中恩诺沙星和环丙沙星量。样品均未检出恩诺沙星和环丙沙星，试剂空白、牛奶加标、牛奶样品的色谱图见图 5。

8 结论

本文建立了离子液体分散液相微萃取结合高效液相色谱测定液态奶中恩诺沙星、环丙沙星药物残留的方法。基于离子液体分散液相微萃取方法操作简便，利用此法取代传统液液萃取使用大量有机试剂，使得样品前处理过程更加方便、环保。该方法简便、快捷，环境友好，灵敏度高，可用于液态奶中喹诺酮类药物恩诺沙星、环丙沙星残留的分析检测。