2017, Vol. 37 
2. 乌海市第三人民医院, 乌海 016000
2. The Third People's Hospital of Wuhai, Wuhai 016000, China
脂肪组织几乎遍布全身，它不仅是机体能量储存的主要场所，更是一个活跃的内分泌器官。体内脂肪的大量沉积会引起机体一系列生理功能的改变，同时体内脂肪的沉积与脂类疾病成正比，其中以高脂血症最为常见。目前大量临床实践证实，高脂血症可以引起心脑血管系统疾病，也是糖尿病、糖耐量异常等代谢性疾病发生的主要诱因[1-2]。采用中草药防治高脂血症已经成为当今研究的热点之一，也取得了一定的成果。野艾蒿为菊科蒿属多年生草本植物，经鉴定其叶、茎部分作为蒙药童格勒格-1主要成分[3]。蒙药童格勒格-1是一种单味的蒙药制剂，在临床上表现出降脂、抗炎的作用。经本文作者所在研究团队的前期研究发现[4]，蒙药童格勒格-1对高脂大鼠有较好的降低血脂的作用，其乙酸乙酯提取部分可明显提高大鼠BRL肝细胞的低密度脂蛋白受体（LDLR）的表达。为了进一步寻找野艾蒿降血脂作用的有效成分，本项目组对其乙酸乙酯提取部分进行分离，得到了木犀草素、柚皮素、槲皮素、芹菜素4种黄酮类化合物[5]。基于上述研究，作者预想野艾蒿的黄酮类化合物可能为其有效成分，并通过作用于细胞中的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和磷酸脂酸磷水解酶1（LPIN1）的表达来调控血脂的代谢及抗肿瘤作用。
LPIN1基因是LPIN家族的一员，是调控脂肪细胞分化与脂类代谢的关键基因。有报道显示，无论通过体内还是体外的研究，都证明LPIN1是成熟脂肪细胞中的正调节蛋白[6]。在LPIN1缺失的小鼠和LPIN1缺失的细胞中发现的脂肪细胞的分化不能被诱导表达，表明LPIN1在早期形成脂肪的过程中起到了相当重要的作用[7]。AMPK是参与细胞生物调节及代谢的一种关键酶，可感受细胞内一磷酸腺苷/三磷酸腺苷（AMP/ATP）浓度比值的变化，进而调节细胞的能量代谢[8-9]。近年来，研究发现AMPK与肿瘤关系密切，AMPK的激活可以抑制多种肿瘤细胞的增殖[10-11]。本实验以HepG2细胞为研究对象，通过用野艾蒿乙酸乙酯提取部分分离得到的4种黄酮类化合物来干预HepG2细胞，观察HepG2细胞AMPKα和LPIN1的表达及AMPK活性的变化，从分子水平探明其降血脂的有效成分及可能作用机制。
1 仪器与试剂 1.1 药物植物标本经内蒙古科技大学包头医学院药用植物教研室王振旺老师鉴定为菊科蒿属植物野艾蒿Artemisia lavandulaefolia DC.的全草。4种黄酮类成分木犀草素、柚皮素、槲皮素、芹菜素均由课题组从野艾蒿乙酸乙酯部位提取分离[5]，纯度98%。
1.2 细胞株人肝癌HepG2细胞株，购自中科院上海细胞研究所。
1.3 仪器CO2培养箱（Thermo Foma公司）；酶标仪（Bio—Rad公司）；倒置显微镜（Oliympus公司）；SW—cJ超净工作台（上海新苗医疗器械有限公司）；Real-Time PCR仪（Applied Biosystems 7900 Fast Real-Time PCR System）；Western分析仪器（BIO-Rad Laboratories）。
1.4 试剂四甲基偶氮唑蓝（MTT）、胎牛血清、DMEM、二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶均购自北京索莱宝科技有限公司；反转录聚合酶反应试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；引物购自上海生物工程有限公司；AMPKα1、AMPKα2、p-AMPK、LPIN1抗体购自Cell signaling公司，二抗购自中杉金桥公司。
2 方法 2.1 细胞培养按常规方法将HepG2细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基（含100 U·mL-1青霉素与100 U·mL-1链霉素），37 ℃、5%CO2培养箱内培养。观察细胞生长状态，在细胞对数生长期用0.25%胰酶消化，计算配成1×104·mL-1细胞悬液接种于96孔板内，每孔100 mL，设置4个复孔。用DMEM高糖细胞培养液作为溶剂，将木犀草素、柚皮素、槲皮素、芹菜素4种黄酮化合物分别配制成0.001、0.005、0.008、0.01、0.03 mg·mL-1 5个浓度的待用药物溶液。将接种后的细胞分为空白组、用药组和对照组3个组，空白组只加培养基不接种细胞，用药组按以上5个不同药物浓度加药，对照组则只加培养液不加药物。依次加完后将细胞放入37 ℃、5% CO2培养箱内培养24 h。
2.2 MTT检测培养24 h完毕，将96孔板取出，轻轻吸取板孔内液体，并用PBS缓冲液清洗2次，每孔加入100 μL的培养基和MTT 10 μL后，放入37 ℃、5% CO2培养箱内继续培养。4 h后取出96孔板，轻轻吸取孔内液体后每孔再加入DMSO 100 μL，在震荡仪上震荡15 min，使孔内结晶充分溶解；之后在490 nm波长下用酶标仪检测。计算细胞生长抑制率（IR），实验重复3次。
2.3 计算公式细胞生长抑制率（IR）=（1－用药组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。
2.4 Real time-PCR方法检测基因表达应用Real time-PCR方法检测LPIN1、AMPKα1、AMPKα2和β-actin mRNA的表达。首先用Trizol试剂提取正常对照组和不同药物组细胞总RNA，之后用紫外分光光度计测定其OD260 nm和OD280 nm值，并根据OD260 nm/OD280 nm值估计纯度及计算RNA浓度，然后根据反转录试剂盒操作说明书将其反转录成cDNA；PCR反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，40个循环；收集其循环延伸反应最后时刻的荧光信号，应用Real time-PCR仪检测。
PCR引物设计如下：
AMPKα1：上游引物5′-GCACCTTCGGCAAAGTGAAG-3′，下游引物5′-ATTGTGGCCCTCATGGG-3′；AMPKα2：上游引物5′-ACCTCAGCGTTCCTGTTCTG-3′，下游引物5′-CAAAGCAAGGAGTTGCC-3；LPIN1：上游引物5′-GTTTGCAATACAAAGGCGGC-3′，下游引物5′-GGACCCCCATCTTCCCAAAG-3；β-actin：上游引物5′-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3′，下游引物5′-AGCACTGTGTTGTACAG-3′。
2.5 Western blot方法检测蛋白水平表达6孔板培养HepG2细胞，分为对照组和药物组，对照组不加药，药物组依次加入质量浓度为0.01 mg·mL-1的木犀草素、柚皮素、槲皮素和芹菜素，培养24 h。诱导24 h的药物组和对照组细胞每孔加200 μL细胞蛋白裂解液和蛋白抑制剂，静置10 min后收集细胞，12 000 r·min-1下离心10 min，轻取上清液，获得细胞总蛋白样品，并测定蛋白浓度。取20 μg蛋白样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行10% SDS-PAGE电泳、转膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，分别加入AMPKα1（1:1 000）、AMPKα2（1:1 000）、p-AMPK（1:2 000）、LPIN1（1:1 000）和β-actin（1:1 000）抗体，4 ℃过夜。次日用TBST洗膜3遍，用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（1:4 000）37 ℃避光孵育2 h，之后用化学发光试剂（electrochemiluminescence，ECL）化学发光反显影，用Bio图像软件进行分析。
3 统计学分析处理将所有实验数据均用SPSS 17.0统计软件进行数据处理分析，计量资料用均数加减标准差（x±s）表示，组间比较采用配对t检验分析，以P < 0.05为有统计学意义。所有实时荧光定量PCR检测得到的数据的Ct值通过内参基因（β-actin）的Ct值均一化，即ΔCt=Ct-Ctβ-actin，mRNA相对值以ΔΔCt值表示：ΔΔCt=2-ΔCt，Ct表示PCR系统中每个反应管内的荧光信号到达阈值时的循环数，ΔCt是指目的基因与参照基因的Ct值之差。采用Image J、SPSS 17.0统计软件对Western blot结果进行统计学分析，以P < 0.05为有统计学意义。
4 结果 4.1 MTT实验结果实验结果显示，野艾蒿中提取的木犀草素、柚皮素、槲皮素和芹菜素4种黄酮类单体化合物在不同浓度下作用于HepG2细胞24 h，均可出现不同程度的抑制HepG2细胞增殖的作用。结果见表 1。
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表 1 不同浓度药物作用于HepG2细胞24 h的抑制率（x±s，n=4） Table 1 The inhibition rate of HepG2 cells affected by drugs of different concentration in 24 h |
根据MTT实验结果筛选，要求药物对细胞的抑制率在15%~25%区间。因为该条件下的药物对细胞的抑制率既可以使得药物对细胞有抑制作用，也可以让细胞继续生长（存活率75%~85%）。若抑制率太低，则体现不出药物对细胞活性的影响；若抑制率太高，影响细胞生长，从而影响后续实时荧光定量PCR和Western blot实验时，从细胞中提取总RNA和总蛋白的数量。本课题组前期研究结果中，蒙药童格勒格-1作用大鼠肝细胞[1]最适质量浓度0.01 mg·mL-1，因此基于前期研究和本实验结果，选取浓度0.01 mg·mL-1、作用时间24 h为最适用药条件。
4.3 镜下细胞观察结果在倒置显微镜下观察细胞，发现对照组HepG2细胞增殖良好，细胞形状明显，边缘清晰，细胞结合紧密，细胞内杂质颗粒少。不同药物作用于HepG2细胞后可以看到，药物作用的细胞均有着不同程度的变化：可见部分细胞形态由多角状变为梭形和圆形，细胞结合不整齐，有间隙，细胞内可看到杂质颗粒。与对照组细胞比较，槲皮素和芹菜素细胞量明显减少，胞质内颗粒开始聚集，镜下见到部分细胞逐渐脱落和裂解，其形态变化最大，见图 1。
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图 1 质量浓度为0.01 mg·mL-1的木犀草素、柚皮素、槲皮素、芹菜素作用HepG2细胞24 h时镜下细胞形态（100×，与对照组细胞形态作比较） Figure 1 0.01 mg·mL-1 luteolin, naringenin, quercetin, apigenin in HepG2 cells with 24 h on the morphology of cells under microscope(100×, compare with control group) |
如图 2所示，通过实时荧光定量PCR检测发现，4个药物组细胞（木犀草素、柚皮素、槲皮素、芹菜素）AMPKα1 mRNA以β-actin为内参得到各组相对表达量。对照组0.61±0.12，木犀草素组0.41±0.21，柚皮素组0.98±0.39，槲皮素组0.79±0.23，芹菜素组0.38±0.07；可以看出，4个药物组细胞AMPKα1mRNA表达量与对照组比较均无显著性差异（P > 0.05，n=4）。
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图 2 4种药物作用HepG2组细胞AMPKα1 mRNA表达量（与对照组相比，P > 0.05，n=4） Figure 2 The expression levels of AMPKα1 mRNA in four experimental groups of HepG2 clles(compared with control group, P > 0.05, n=4) |
如图 3所示，4个药物组细胞（木犀草素、柚皮素、槲皮素、芹菜素）AMPKα2 mRNA以β-actin为内参得到各组相对表达量。对照组1.29±0.24、木犀草素组2.51±0.86，柚皮素组2.21±0.35，槲皮素组3.54±0.35，芹菜素组1.18±0.22；可以看出，4个药物组细胞AMPKα2mRNA表达中，柚皮素和槲皮素组mRNA表达量与对照组比较有显著性差异，说明有统计学意义（P < 0.05，n=4）。
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图 3 4种药物作用HepG2组细胞AMPKα2 mRNA表达量（与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，n=4） Figure 3 The expression levels of AMPKα2 mRNA in four experimental groups of HepG2 clles(compared with control group, *P < 0.05, **P < 0.01, n=4) |
如图 4所示，4个药物组细胞（木犀草素、柚皮素、槲皮素、芹菜素）LPIN1 mRNA以β-actin为内参得到各组相对表达量。对照组1.16±0.09，木犀草素组0.38±0.05，柚皮素组0.37±0.03，槲皮素组0.62±0.05，芹菜素组0.37±0.01；可以看出，4个药物组细胞LPIN1 mRNA表达量与对照组比较，表达水平均显著降低，说明有统计学意义（P < 0.01，n=4）。
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图 4 4种药物作用HepG2组细胞LPIN 1 mRNA表达量（与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，n=4） Figure 4 The expression levels of LPIN1 mRNA in four experimental groups of HepG2 clles(compared with control group, *P < 0.05, **P < 0.01, n=4) |
如图 5所示，4个药物组细胞AMPKα1蛋白以β-actin为内参得到各组相对表达量。对照组0.26±0.02，木犀草素0.21±0.05，柚皮素0.31±0.04，槲皮素0.23±0.01，芹菜素0.18±0.05，熊果酸0.19±0.02；药物组AMPKα1蛋白表达与对照组比较，均无显著性差异（P > 0.05，n=4）。
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图 5 4种药物作用HepG2组细胞AMPKα1蛋白表达量（与对照组相比，P > 0.05，n=4） Figure 5 The expression levels of AMPKα1 protein in four experimental groups of HepG2 cells(compared with control group, P > 0.05, n=4) |
如图 6所示，4个药物组细胞AMPKα2蛋白以β-actin为内参得到各组相对表达量。对照组0.72±0.14，木犀草素1.31±0.16，柚皮素1.48±0.10，槲皮素1.68±0.31，芹菜素1.21±0.15；药物组AMPKα2蛋白表达与对照组比较，均有统计学意义（P < 0.05，n=4），且表达水平均明显升高。
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图 6 4种药物作用HepG 2组细胞AMPKα2蛋白表达量（与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，n=4） Figure 6 The expression levels of AMPKα2 protein in four experimental groups of HepG2 cells(compared with control group, *P < 0.05, **P < 0.01, n=4) |
如图 7所示，4个药物组细胞LPIN1蛋白以β-actin为内参得到各组相对表达量。对照组0.44±0.02，木犀草素组0.24±0.03，柚皮素组0.21±0.01，槲皮素组0.35±0.03，芹菜素组0.31±0.04；可以看出，4个药物组细胞LPIN1蛋白表达量与对照组比较，蛋白表达水平均明显降低，有显著性差异，说明有统计学意义（P < 0.01，n=4）。
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图 7 4种药物作用HepG 2组细胞LPIN1蛋白表达量（与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，n=4） Figure 7 The expression levels of LPIN1 protein in four experimental groups of HepG2 cells(compared with control group, *P < 0.05, **P < 0.01, n=4) |
如图 8所示，4个药物组细胞p-AMPKα蛋白以β-actin为内参得到各组相对表达量。对照组0.29±0.01，木犀草素组0.39±0.08，柚皮素组0.42±0.03，槲皮素组0.47±0.03，芹菜素组0.55±0.03；可以看出，4个药物组细胞p-AMPKα蛋白表达量与对照组比较，p-AMPK蛋白表达量磷酸化水平均明显升高，有显著性差异，说明有统计学意义（P < 0.01，n=4）。
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图 8 4种药物作用HepG 2组细胞p-AMPK蛋白表达量（与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，n=4） Figure 8 The expression levels of p-AMPK protein in four experimental groups of HepG2 cells(compared with control group, *P < 0.05, **P < 0.01, n=4) |
AMPK被称为“细胞能量感受器”[12]，在调节细胞脂质代谢过程中发挥着重要作用。AMPK功能异常会引起许多机体代谢紊乱。目前临床所使用的改善代谢紊乱的药物，大多是通过激活AMPK起调节作用，被认为是治疗肥胖和高血脂症等代谢失调性疾病的重要靶点。本实验采用人肝癌HepG2细胞进行细胞增殖实验研究，通过MTT法对体外HepG2细胞进行了不同浓度和时间的药物干扰，并与前期实验结果相结合，筛选出最合适的作用条件，应用Real time-PCR和Western blot方法观察野艾蒿提取的4种单体化合物对HepG2细胞AMPKα1、AMPKα2、LPIN1基因和蛋白的表达及AMPK活性的变化。结果发现，4种单体化合物（木犀草素、柚皮素、槲皮素、芹菜素）均可通过磷酸化AMPKa亚基（Phospho-AMPKα）Thr-l72位点，进而激活AMPK。在脂肪组织中，被激活的AMPK可增加脂肪酸氧化，并减少体内脂肪和甘油三酯的合成。
5.1 4种黄酮类化合物对HepG2细胞抑癌作用野艾蒿提取的木犀草素、柚皮素、槲皮素、芹菜素4种黄酮类单体化合物作用于人肝癌HepG2，均可不同程度抑制HepG2细胞的增殖。提示野艾蒿可能成为预防及治疗肿瘤的一种有效药，可为以后临床应用此类药物提供可靠的实验数据。
5.2 4种黄酮类化合物AMPK基因与蛋白水平的表达AMPK既可因AMP/ATP的浓度比值升高直接变构激活，也可通过与AMP相结合导致上游激酶AMPK更易磷酸化其α亚基Thr-l72位点而被激活[13]。本研究将木犀草素、柚皮素、槲皮素、芹菜素4种单体化合物作用于HepG2细胞，结果发现，与对照组比较，4种药物AMPKα1基因和蛋白表达均无显著性差异。柚皮素和槲皮素可增加AMPKα2基因表达；而木犀草素、芹菜素AMPKα2基因表达无显著性差异：原因可能是在实验操作加样过程中，复孔之间误差较大，导致数据分析时误差条（error bar）太大，影响其统计学意义（如木犀草素）；还有可能是mRNA在转录过程发生降解从而使表达下降，但蛋白翻译后稳定存在。研究结果还表明，4种药物均可增加AMPKα2和p-AMPK蛋白的表达水平。目前已有文献指出，肿瘤抑制因子（LKB1）和钙调蛋白依赖性激酶（CaMKK）被认为是2种主要的上游激酶。LKB1在应答机体能量需求和维持代谢平衡中起着重要的作用，被认为是活化AMPK的主要途径，它既可通过磷酸AMPKα亚基的Thr-172位点直接变构激活AMPK，也可调控AMPK和AMP相关的蛋白激酶活性[14]，是一种强有力的AMPK调节器[15-16]。Lee等[17]在乳腺癌MCF-7和结肠癌HT-29细胞发现，槲皮素可通过AMPK/COX-2通路诱导肿瘤细胞的凋亡，槲皮素通过刺激活性氧类（reactive oxygen species，ROS）的产生激活AMPK。还有研究报道[18-19]，芹菜素可通过AMPK信号通路调节3T3-L1细胞脂肪集聚，对心血管疾病的防治和健康有着重要意义，但未指出具体是通过何种途径激活AMPK。本实验结果提示，野艾蒿提取的4种药物至少可能通过以下2种途径来调节机体脂类和糖的代谢：一是通过增加AMPKα2蛋白的表达量，导致AMPK激活量增加；二是通过激活AMPK信号通路中的部分上游激活物，如LKB1、CAMKK、AMP/ATP、ROS等，进而磷酸化AMPKa亚基Thr-l72位点激活AMPK，或4种药物直接激活AMPK。
宋玉萍等[20]通过二甲双胍对糖尿病大鼠脂肪组织AMPKα2及氧化应激水平的影响作出研究，发现二甲双胍治疗后的大鼠脂肪组织中AMPKα2水平高于对照组，说明二甲双胍能上调糖尿病大鼠脂肪组织中AMPKα2的表达，二甲双胍可能通过增加脂肪组织中AMPKα2含量来调节血糖、血脂代谢，改善胰岛素抵抗。这也提示本实验野艾蒿提取的4种药物除了可以调节血脂外，还很有可能参与糖代谢，抵抗氧化应激作用，但尚需进一步证实。野艾蒿提取的4种药物均使p-AMPK（Thr-172）表达水平升高，但同时又使LPIN1基因与蛋白表达水平均降低。现已研究发现，AMPK的下游靶点羟甲基戊二酸CoA（HMG-CoA）还原酶和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）分别是TG和脂肪酸合成的关键酶，在脂类代谢调节方面有重要作用。有文献报道AMPK活性的增加可使ACC失活，进而使体内丙二酰辅酶A合成减少，激活肉毒碱棕榈酰转移酶1（CPT-1），相应的促进了长链酯酰辅酶A从细胞质进入线粒体的氧化，降低脂质在外周组织的沉积，增强了脂肪酸氧化作用[21]。通过本研究的结果，可以推测AMPK通路与LPIN1之间可能存在某种调节关系，很可能LPIN1作为AMPK信号通路中，p-AMPK作用的一个下游把基因，从而降低其LPIN1活性，促进脂肪氧化，从而抑制脂肪酸的合成。
5.3 4种黄酮类化合物LPIN1基因与蛋白水平的表达LPIN1作为一种新的脂肪因子，在机体脂肪代谢中起到关键作用。牛茂源等[22]对LPIN1基因突变与奶牛脂肪肝发生的关联性做出的相关研究指出，患脂肪肝奶牛的LPIN1总体含量要高于阴性对照组，奶牛脂肪肝与LPIN1基因具有一定相关性；研究还指出，无论是在脂肪组织还是肌肉组织中增加LPIN1的表达均能促进肥胖。本研究发现，无论是基因还是蛋白水平，4种药物对LPIN1均起到下调趋势，提示野艾蒿中木犀草素、柚皮素、槲皮素、芹菜素4种单体化合物可能调控脂质代谢相关基因，野艾蒿降血脂的作用机制可受其调控影响。目前有关AMPK与LPIN1具体的调控机制的研究还很少，未来可通过转基因或基因沉默方法，进一步验证LPIN1和AMPK信号通路之间存在何种调控机制。另外，Harris等[23]发现在胰岛素信号通路中，LPIN1是下游靶基因，在胰岛素的刺激作用下，LPIN1苏氨酸、丝氨酸位点磷酸化。黄德强等[24]通过AMPK在胰岛素信号转导通路中研究发现，胰岛素能增加AMPK催化亚基Thr-172的磷酸化。另外，本研究在基因和蛋白表达水平提示，LPIN1可能在AMPK信号通路间存在潜在作用，有待进一步的研究。
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