2019,Vol. 15
文章信息
- 陈春
- CHEN Chun
- 独角石斛组培快繁技术
- Rapid propagation system for tissue culture of Dendrobium unicorneum
- 亚热带农业研究, 2019, 15(4): 257-261
- Subtropical Agriculture Research, 2019, 15(4): 257-261.
- DOI: 10.13321/j.cnki.subtrop.agric.res.2019.04.008
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文章历史
- 收稿日期: 2019-10-12
石斛兰属(Dendrobium)为兰科(Orchidaceae)中的三大属之一，有近2 000种原生种，主要分布在亚洲的热带、亚热带地区及大洋洲[1]。石斛兰花色鲜艳、摆放观赏时间长且品种繁多，园艺及观赏价值较高。独角石斛是石斛兰的一个小型种，其唇瓣反转似犀牛角，花瓣橙红色，唇瓣上布有深橙红色网纹。通常利用观赏石斛的植株侧芽进行分株繁殖以获得种苗。但兰科植物不易发芽，分株繁殖慢且生长不一致，因此，组培技术在观赏石斛上的应用前景广阔[2-3]。近年来，国内已有石斛兰组培方面的研究，大多以其种子作为外植体，较少以侧芽作为外植体[4-11]。本试验以独角石斛侧芽为外植体，对组培过程进行系统研究，以期为观赏石斛组培快繁及规模化生产提供参考。
1 材料与方法 1.1 供试材料供试材料为栽培于福建省林业科技试验中心五板桥基地温室中的2年生独角石斛，取其生长健壮、无病虫害的当年生侧芽作为外植体。
1.2 试验方法 1.2.1 外植体的消毒与诱导在天气晴朗的下午，剪取生长健壮、无病虫害独角石斛侧芽为外植体。将剪下的侧芽用0.1%洗衣粉浸泡5 min左右，之后切成5 cm茎段，用自来水冲洗3~5遍，放置于超净工作台上。用体积分数为75%酒精溶液消毒30~60 s，再用HgCl2消毒15~20 min，最后用无菌水冲洗3~5遍，切割成2~3 cm茎段，接种到诱导培养基上。诱导培养基以MS+0.2 mg·L-1 NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂为基本培养基，并添加了不同质量浓度的6-BA。6-BA是石斛兰芽诱导较为重要的生长调节剂，适宜的浓度有利于不定芽的增殖。6-BA分别设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·L-1，诱导培养基相应代号为Y1~Y6。每种培养基接种30瓶，每个培养瓶接种1个外植体，重复3次。培养15 d后统计污染情况，培养30 d后统计不定芽的诱导率。
| $ 污染率/\% = \left( {污染的外植体瓶数/接种瓶数} \right) \times 100 $ |
| $ 诱导率/\% = \left( {外植体分化瓶数/无菌瓶数} \right) \times 100 $ |
将诱导培养获得的不定芽切下，接到继代增殖培养基中进行培养。6-BA和KT有利于不定芽的增殖，少量NAA有利于不定芽的生长。为此，以MS+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂为基本培养基，分别添加不同质量浓度的6-BA、KT、NAA(表 1)。利用L9(34)正交试验，分析不同激素水平对独角石斛丛生芽增殖系数的影响。每个处理接种30瓶，每瓶接种1个不定芽，3次重复。45 d后统计丛生芽的增殖及生长情况。
| 水平 | 因素 | ||
| ρ6-BA/(mg·L-1) | ρKT/(mg·L-1) | ρNAA/(mg·L-1) | |
| 1 | 1.5 | 0.0 | 0.1 |
| 2 | 2.0 | 0.5 | 0.2 |
| 3 | 2.5 | 1.0 | 0.4 |
将继代增殖培养获得的3 cm以上的丛生芽切下，接种到壮苗生根培养基中培养。生长素NAA和IBA对不定根的诱导有促进作用。本试验以1/2MS+0.5 g·L-1 AC+30 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉胶为基本培养基，添加50 g·L-1土豆、50 g·L-1香蕉泥，NAA分别设置为0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·L-1，IBA为0.5 mg·L-1，壮苗生根培养基代号为R1~R5。比较不同质量浓度NAA及IBA对独角石斛生根情况的影响。每种培养基接种30瓶，每瓶接5丛，3次重复，45 d后统计生根苗生长状况。
1.2.4 组培苗的移栽当壮苗生根培养获得的生根苗长至5 cm以上，将瓶苗炼苗15 d后即可移栽。清洗组培苗根部的残留培养基，再用质量分数为0.1%多菌灵消毒15 s，之后种植在消毒处理过的水苔及树皮屑基质中，于温室大棚中培育。由于水苔和树皮屑的透气性和保水性好，适合石斛兰的移栽，本试验设置3个处理：T1为水苔；T2为水苔与树皮屑以1:1混合；T3为树皮屑。每种培养基质种植30丛组培苗，3次重复。栽培期间应注意遮荫、喷水保湿，移栽45 d后观察小苗的移栽成活率及生长情况。
1.2.5 培养条件组培培养室温度为23~25 ℃，光照周期为10 h·d-1，光照强度为2 000 lx；温室大棚湿度控制在70%~85%，温度25~30 ℃。
2 结果与分析 2.1 6-BA质量浓度对独角石斛不定芽诱导的影响外植体培养15 d左右，不定芽开始萌发，30 d左右可统计不定芽的诱导率。由表 2可知，不同质量浓度6-BA对不定芽的诱导率存在显著差异。当6-BA < 1.0 mg·L-1或>2.0 mg·L-1时，不利于不定芽的诱导; 当6-BA为2.0 mg·L-1时，诱导率最高，达95.5%，不定芽生长健壮，叶片绿色；上升至3.0 mg·L-1时，诱导率降低，不定芽出现玻璃化现象。因此，以独角石斛侧芽为外植体可诱导出不定芽，在基础培养基MS中添加2.0 mg·L-1 6-BA和0.2 mg·L-1 NAA，不定芽的诱导效果最好。
| 培养基 | ρ6-BA | 诱导率 | 不定芽生长情况 |
| mg·L-1 | % | ||
| Y1 | 0.5 | 53.0dD | 生长健壮，叶片绿色 |
| Y2 | 1.0 | 87.6cC | 生长健壮，叶片绿色 |
| Y3 | 1.5 | 91.2bB | 生长健壮，叶片绿色 |
| Y4 | 2.0 | 95.5aA | 生长健壮，叶片绿色 |
| Y5 | 2.5 | 52.5dD | 生长较细，叶片绿色 |
| Y6 | 3.0 | 38.0eE | 生长细弱，有玻璃化现象 |
| 1)同列数值后附不同大小写字母者分别表示差异达0.01、0.05显著水平。 | |||
不定芽接种到继代增殖培养基后，其增殖速度快，45 d后可长成丛状(图 1)。方差分析表明，对独角石斛增殖系数影响最大的因素是6-BA，其次是KT，这两个因素的P值均为0，说明6-BA和KT对增殖系数的影响极显著(表 3)。NAA对独角石斛增殖系数的影响不显著。
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图 1 独角石斛继代瓶苗 Figure 1 Subculture seedlings of D.unicorneum |
| 变异来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 |
| ρ6-BA | 43.628 8 | 2 | 21.814 4 | 1 313.858 7 | 0.000 0 |
| ρKT | 1.021 4 | 2 | 0.510 6 | 30.754 8 | 0.000 0 |
| ρNAA | 0.115 3 | 2 | 0.057 6 | 3.471 2 | 0.050 8 |
| 误差 | 0.332 1 | 2 | 0.016 6 | ||
| 总和 | 45.097 5 |
正交试验方差分析显示，5号独角石斛增殖系数(4.78)最大，在0.01水平上显著差异于其他处理的培养基(表 4)。因此，选择独角石斛的最适增殖培养基为：MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT+0.4 mg·L-1 NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂。
| 处理 | 增殖系 数均值 |
5%显著 水平 |
1%显著 水平 |
| 5 | 4.78 | a | A |
| 4 | 4.50 | b | B |
| 6 | 4.28 | c | B |
| 8 | 2.62 | d | C |
| 9 | 2.20 | e | D |
| 7 | 2.10 | e | D |
| 2 | 1.70 | f | E |
| 1 | 1.65 | f | E |
| 3 | 1.20 | g | F |
当不定芽长至3 cm时，将其切下并转接到培养基上，经25 d的生根诱导培养，可获得生根组培苗(图 2)。由表 5可知，当NAA < 0.4 mg·L-1时，不定根的生根率和生根条数均随着NAA浓度的提高而增加，R1~R3处理生根条数呈极显著差异；当NAA为0.4 mg·L-1时，生根率达100%，根数达5.7条；当NAA>0.4 mg·L-1时，对不定根的诱导反而不利。由表 5还可知，仅添加IBA或NAA时，生根率及生根条数都极显著低于添加NAA+IBA的组合。因此，最佳生根培养基为：1/2 MS+0.4 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 IBA+0.5 g·L-1 AC+50 g·L-1土豆+50 g·L-1香蕉泥+20 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉胶。
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图 2 独角石斛生根苗 Figure 2 Rooting seedlings of D.unicorneum |
| 编号 | ρNAA | ρIBA | 生根率 | 生根数 | |||
| mg·L-1 | mg·L-1 | % | 条·株-1 | ||||
| R1 | 0.0 | 0.5 | 85.7dD | 2.5dD | |||
| R2 | 0.2 | 0.5 | 100.0aA | 4.5bB | |||
| R3 | 0.4 | 0.5 | 100.0aA | 5.7aA | |||
| R4 | 0.6 | 0.5 | 95.5bB | 5.5aA | |||
| R5 | 0.8 | 0.0 | 92.5cC | 4.2cC | |||
| 1)同列数值后附不同大小写字母者分别表示差异达0.01、0.05显著水平。 | |||||||
从表 6可见，不同基质对独角石斛组培苗的移栽成活率有显著影响。以水苔作为基质时，成活率(90.5%)最高且茎粗壮、叶色深绿，苗长势好(图 3)；以水苔:树皮屑为1:1作为基质时，成活率较低；以树皮屑为基质，成活率最低且长势较弱。因此，选择水苔作为独角石斛的移栽基质。
| 编号 | 基质 | 成活率/% | 长势情况 |
| T1 | 水苔 | 90.5aA | 茎粗壮，叶色深绿 |
| T2 | 水苔:树皮屑为1:1 | 86.3bB | 茎粗壮，叶色深绿 |
| T3 | 树皮屑 | 78.5cC | 茎较细弱，叶色绿 |
| 1)同列数值后附不同大小写字母者分别表示差异达0.01、0.05显著水平。 | |||
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图 3 移栽45d的独角石斛组培苗 Figure 3 Seedlings of D.unicorneum transplanted for 45 d |
目前独角石斛尚未在市场上大量销售，关于其组培技术的报道较少。本试验以独角石斛侧芽作为外植体诱导不定芽，筛选出了最佳继代增殖培养基、生根培养基及栽培基质，以期为其产业化生产提供参考。不定芽诱导的最适培养基为：MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂，诱导率最高，达95.5%；丛生芽的最适增殖培养基为：MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT+0.4 mg·L-1 NAA+30 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1琼脂，增殖系数达4.78；最适生根培养基为：1/2 MS+0.4 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 IBA+0.5 g·L-1 AC+50 g·L-1土豆+50 g·L-1香蕉泥+20 g·L-1蔗糖+7.0 g·L-1卡拉胶，生根率达100%，苗生长健壮；组培苗经15 d炼苗后，移栽到水苔基质中，45 d后成活率达90.5%。
本研究表明，以MS为基本培养基适合石斛丛生芽的增殖继代培养，这结果与蒙阳等[12]研究相一致。为了提高独角石斛移栽成活率，本试验通过在生根培养基中添加土豆、香蕉泥进行边生根边壮苗，提高了组培苗移栽成活率，与高燕等[13]研究相一致。
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