绿肥是农业生产中重要的有机生物肥源，绿肥压青还田能够改善土壤理化性质、提高作物产量、增加土壤肥力^[1]。土壤微生物是土壤生态系统中最活跃的部分^[2]，在土壤有机物的分解与合成、腐殖质的形成及养分循环等生态过程中具有不可忽视的作用^[3-5]，土壤结构、颗粒大小、有机质含量都会影响土壤微生物的群落结构^[6]。胡亚林等^[7]研究表明，施用不同类型肥料能改变土壤理化性质，影响地上植物的生长发育，从而间接影响土壤微生物群落。已有研究表明，绿肥、厩肥等有机肥既能够补充土壤有机碳源，又能够改善土壤的理化性状，有利于提高土壤微生物的活性及其多样性^[8-10]；部分土壤根际微生物可在植物根部周围形成保护屏障，防治植物病害。因此，土壤微生物常被作为评价土壤生态环境质量的重要指标^[11]。

烤烟是贵州七大经济作物之一。贵州是我国第二大烤烟种植区，但当地土壤耕作与施肥方式单一，单作且连作面积较大。李远远^[12]研究表明，随着连作年限的增加，烟田土壤微生物多样性下降。合理的耕作管理方式是提高烤烟生产力的重要措施，为此，本试验在贵州省福泉市采用绿肥压青的还田方式，研究不同压青量对烤烟根际可培养微生物的影响，以了解绿肥压青还田对改良土壤生态的作用。

1 材料与方法 1.1 试验地概况

试验于2018年4―9月在贵州省福泉市藜山乡猴昌坪(107°36′24″E，26°43′8″N)进行，烤烟品种为云烟87，压青材料为光叶紫花苕(Viciavillosa rothvar)。试验地为黄壤，地势平坦、灌溉方便，距离公路500 m以上，连续覆盖地膜多年、肥力中等且相对均匀，在上一种烟季烟草花叶病、青枯病、黑胫病和根结线虫病等病害发生较轻。试验地海拔937 m，为亚热带季风湿润气候。

1.2 试验设计

光叶紫花苕进入盛花期时收割鲜草并切成10~20 cm的节段铺于地上，于烤烟春耕备栽时整地起垄并翻压入土。翻犁，翻压深度20 cm。本试验压青量设4个处理。处理1为光叶紫花苕收割后直接起垄(压青量为0 kg·hm^-2，CK)；处理2~处理4压青量分别为15.0、22.5、30.0 t·hm^-2。完全随机区组设计，3次重复，12个小区，行距为1.1 m、株距为0.6 m，小区面积为40 m²。

1.3 土壤可培养微生物的分离与初步鉴定 1.3.1 分离

分别于移栽后30、60、90和120 d对各处理烟垄进行根际土壤取样。采用5点取样法，采集1 kg新鲜根际土壤，装于打孔透气的自封袋内。取样当天立即送贵州大学植物病理学实验室，采用稀释平板法^[13]进行土壤可培养微生物分离。其中，分离真菌的悬浮液稀释倍数分别为10²、10³，采用PDA培养基分离培养；放线菌的悬浮液稀释倍数分别为10³、10⁴，采用“高氏一号”培养基分离培养；细菌的悬浮液稀释倍数分别为10⁴、10⁵，采用NA培养基分离培养。纯化后的真菌、细菌和放线菌先根据形态特征加以初步判断，将其中菌落特征一致的菌株归为一类保存后再用于种类鉴定。

1.3.2 初步鉴定

参考宋晓兰^[14]的方法，基于分离物的形态特征和序列同源性比对，对烤烟移栽后30、60、90和120 d的烟垄根际土壤真菌、细菌和放线菌的属或可能种进行初步鉴定。(1)真菌。用无菌接种针挑取培养好的真菌，于显微镜下观察产孢结构及孢子形态特征，并参考文献[15]进行属或种的鉴定。进行序列同源性比对时，采用BIOMIGA公司的小量提取试剂盒提取真菌gDNA，PCR扩增引物为ITS1/ITS4^[16]。(2)细菌。先进行革兰氏染色并观察菌体形态，芽孢杆菌属则进行芽孢染色^[13]。进行序列同源性比对时，采用BIOMIGA公司的小量提取试剂盒提取细菌gDNA，扩增引物为16S rDNA通用引物27F/1492R。(3)放线菌。参考阮继生等^[17]方法初步鉴定到属。进行序列同源性比对时，采用BIOMIGA公司的小量提取试剂盒提取放线菌gDNA，扩增引物为16S rDNA通用引物27F/1492R。

在进行序列同源性比对时，三类微生物的PCR产物经电泳检测，若条带清晰明亮且无杂带，则视为合格。将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果与NCBI数据库已知序列比较同源性。

1.3.3 计数

(1) 采用描点法计算烤烟根际可培养细菌、放线菌和真菌数量^[1]。计算公式^[18]为：

每克土壤样品菌落数=几次重复平板的总菌落平均数×稀释倍数×10

(2) 参照赵丽琨^[19]的方法，将微生物菌属划分为优势属、常见属以及稀有属等3类。分离频率≥10%为优势属；分离频率在1%~10%之间为常见属；分离频率＜1%为稀有属。

分离频率/%=(分离某一微生物菌落数/分离该类微生物菌落总数)×100

1.4 数据处理

使用Excel 2010对试验数据进行统计，并通过SPASS对数据作LSD分析。

2 结果与分析 2.1 压青量对烤烟根际可培养真菌的影响 2.1.1 数量

移栽30~120 d的烤烟根际土壤中真菌数量变化趋势如图 1所示。由图 1可知，移栽30、60、90 d时处理2、处理3和处理4的可培养真菌数比CK高，表明绿肥压青可适当增加土壤中可培养真菌数量。其中，处理2最高。移栽30~90 d，CK可培养真菌数量持续减少，但在90~120 d期间有所增加，具体原因尚待研究。移栽30 d时处理2可培养真菌数量最高，移栽120 d时处理2数量最少。从烤烟根际土壤可培养真菌数量变化来看，处理2较好。

2.1.2 多样性

移栽30 d时，不同压青量处理的烤烟根际真菌种群多样性见表 1。4个处理共分离到可培养真菌427株，初步鉴定为6属32个可能种。4个处理均分离到曲霉属(Aspergillus)真菌，且种类最多，为优势属。其次是球托霉属(Gongronella)和木霉属(Trichoderma)。

2.2 压青量对烤烟根际可培养细菌的影响 2.2.1 数量

不同压青量处理下烤烟移栽30~120 d的根际土壤可培养细菌数量变化见图 2。由图 2可知，移栽30 d时，处理3可培养细菌数量最高，其次是处理2、处理4，CK最低。随着移栽时间的延长，处理2、处理3和处理4均呈持续下降趋势，其中处理3下降最为明显。从图 2还可见，移栽30 d时各处理间可培养细菌数量差距较大，处理3可培养细菌数量为2.5×10⁶ cfu·g^-1，而CK仅0.5×10⁶ cfu·g^-1，随着移栽时间的延长，各处理间差距逐渐缩小，120 d时各处理基本处于同一水平。

2.2.2 多样性

移栽30 d时，不同压青量处理的烤烟根际细菌种群多样性见表 2。从表 2可见，4个处理共分离细菌404株，初步鉴定为6属27个可能种。4个处理均分离到芽孢杆菌属(Bacillus)，为优势属。

2.3 压青量对烤烟根际可培养放线菌的影响 2.3.1 数量

不同压青量处理下烤烟移栽30~120 d的根际土壤可培养放线菌数量变化见图 3。由图 3可知，处理2烤烟根际可培养放线菌数量最多。随着移栽时间的延长，处理2、处理3和处理4可培养放线菌数量均快速下降，但CK在60 d后逐渐上升，到120 d时甚至超过其他3个处理。

2.3.2 多样性

移栽30 d时，不同处理烤烟根际土壤可培养放线菌种群多样性见表 3。4个处理共分离到放线菌141株，初步鉴定为3属25个可能种。从表 3还可看出，放线菌优势属为链霉菌属(Streptomyces)。

3 讨论与结论 3.1 压青量对烤烟根际土壤可培养微生物数量的影响

土壤微生物在土壤元素循环、有机质分解以及腐殖质形成等生物化学过程中具有不可忽视的作用^[20]。绿肥既能够补充土壤有机碳源，还能够改善土壤的理化性状，从而有利于提高土壤微生物活性及其多样性^[10]。本研究表明，采用绿肥压青还田后，对真菌生物量影响最大，其次是细菌和放线菌。从不同处理间的差异来看，绿肥压青比无压青烟田更有利于根际微生物的生长繁殖。细菌和放线菌种类、数量变多有利于土壤养分的转化，通过营养抗性来抵御有害生物如土传病害的生长和繁殖^[21]。罗贞宝^[22]研究表明，土壤真菌数量的增加，一方面能促进有机残体分解，形成一定量的腐殖质；另一方面则可能加剧作物遭受土传植物病原真菌为害的风险。因此，施用适量的绿肥对改善和修复土壤微生态环境具有重要的作用。

杨新才^[23]研究表明，种植光叶紫花苕能增加土壤生物固氮、生物覆盖和生物富集，促进土壤有机质的积累与更新。本研究表明，经光叶紫花苕压青处理的烟田，可显著提高烤烟根际微生物的数量。烤烟移栽30 d时，处理2、处理3和处理4分离到的可培养真菌、细菌和放线菌数量最多，随后均呈下降趋势，表明压青效果逐渐降低；处理1(无压青)的可培养真菌、细菌和放线菌则呈缓慢上升趋势，移栽120 d后，均高于其他3个处理。可能原因如下：一是初期绿肥自带的微生物；二是随时间推移光叶紫花苕中有机氮被分解成无机氮，提高土壤中无机物含量，对微生物繁殖产生抑制作用^[2]。

3.2 压青量对烤烟根际土壤可培养微生物分离频率的影响

本研究表明，不同压青量对烤烟根际土壤可培养微生物分离频率有影响。就可培养真菌而言，压青光叶紫花苕15.0 t·hm^-2(处理2)所分离种类最多，可达10种，其中曲霉属的分离频率最高，为优势种。就可培养细菌而言，压青光叶紫花苕15.0 t·hm^-2(处理2)与22.5 t·hm^-2(处理3)所分离种类最多，达8种，其中芽孢杆菌属的分离频率最高，为优势种。就可培养放线菌而言，压青光叶紫花苕15.0 t·hm^-2(处理2)所分离种类最多，达8种，其中链霉菌属的分离频率最高，为优势种。

综合可培养微生物属的种类及数量，与无压青烟田比较，光叶紫花苕压青能促进烤烟根际微生物的生长，以每公顷(hm²)压青光叶紫花苕15.0 t的烟田较为适宜。