台湾长果桑(Morus macroura Miq.)又名台湾四季长果桑、超级果桑、紫金蜜桑，富含多种维生素，是果桑中最优质的名贵品种之一。长果桑耐热抗冻，种植不受土质和气候的限制，因此在全国各地均可种植^[1]，当前该品种在福建省的栽培面积越来越大^[2]。根结线虫病是桑树的重要寄生线虫病害，受害后病株根系有明显的根结或根瘤，并导致地上部生长迟缓, 叶色发黄、脱落，严重时整株死亡^[3-5]。2015年本课题组在对福建果桑开展病虫害调查时，发现了台湾长果桑的根结线虫病。长果桑根结线虫病在我国大陆为首次报道。本研究通过形态学及分子生物学方法对台湾长果桑根结线虫样本进行种类鉴定，以期为长果桑根结线虫病害的综合防治提供依据。

1 材料与方法 1.1 样本采集

从福建省闽侯县相思岭一果桑园内采集根部有明显根结的台湾长果桑根系样本，以及根系周围的病土500 g，放入保湿自封袋内，注明相应标记后带回实验室进一步分离与鉴定。

1.2 线虫分离与保存 1.2.1 分离

在体视显微镜下通过解剖病根组织直接获得根结线虫的雌虫，并用刀片切取虫体阴部的会阴花纹；采用改良贝尔曼漏斗法分离根际土壤获得雄虫；从病根处获取的单卵囊中孵化获得2龄幼虫^[6]。

1.2.2 保存

将从病根中获取的单卵囊接种到预先培植在灭菌砂土的感病番茄苗根部进行种群繁育。

1.3 形态鉴定

在Nikon Diaphot倒置显微镜下对分离出的雌虫、会阴花纹、雄虫及2龄幼虫进行形态观察，用de Man公式计测形态数值^[6]。

1.4 分子鉴定 1.4.1 DNA提取

单条线虫DNA的提取参照胡永坚等^[7]方法。

1.4.2 特异性引物的PCR扩增

选用Meng et al^[8]及Zijlstra^[9]报道的根结线虫种特异性扩增引物Mi-F/Mi-R、Fjav/Rjav及Far/Rar分别对供试台湾长果桑根结线虫种群进行PCR扩增(表 1)。引物由上海生工合成。

采用25 μL的PCR反应体系：2.0 μL模板DNA，上、下游引物(10 μmol·L^-1)各0.5 μL，10×Taq PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L^-1 dNTP 2.0 μL，Taq酶0.3 μL以及ddH₂O 17.2 μL。具体扩增程序为：94 ℃预变性4 min；变性94 ℃ 30 s，62 ℃/55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，反应共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增结束后，取5 μL PCR扩增产物于浓度为1.0%琼脂糖凝胶中在120 V下电泳30 min，用凝胶成像仪拍照检测。

2 结果与分析 2.1 病株症状

采集中发现果园内大约有25%台湾长果桑植株被根结线虫侵染。轻病株症状不明显；重病株地上部出现植株矮小、黄化、结果减少等生长衰退现象，地下根系表现出明显的根结或根肿等症状(图 1A)。解剖根结可见乳白色近梨形的根结线虫雌虫及根结埋生的褐色卵囊。

2.2 形态鉴定 2.2.1 测量值

台湾长果桑根结线虫形态测量值见表 2。

2.2.2 形态特征

(1) 雌虫。虫体呈梨形或球形，头部骨质化不明显；口针纤细，针锥针杆间界线清晰；排泄孔位于口针基部球附近，到头顶的距离约为1.0~1.2倍口针长度(图 1B)。会阴花纹呈近圆形或方形，背弓中等或较高，线纹平滑或有波浪形纹；侧线不明显，阴肛区无明显线纹；侧尾腺口大，略长于阴门裂的长度(图 1C)。

(2) 雄虫。温热杀死后虫体稍向腹面弯曲；头部不缢缩，隐约可见2~3条唇环；口针较强壮，基部球圆形至扁圆形；背食道腺开口至口针基部球的距离较短；排泄孔位于后食道腺附近，后食道腺从侧腹面覆盖于肠的前端(图 1D)。侧区有4条侧线；交合刺发达，无交合伞；侧尾腺口小，位于泄殖腔前方(图 1E)。

(3) 2龄幼虫。虫体蠕虫形，纤细，温热杀死后稍向腹面弯曲；头部骨质化弱，口针细小，有小的基部球；排泄孔位于后食道腺前端近水平处，食道腺从虫体的侧腹面覆盖于肠(图 1F)。尾呈锥状，近尾端处常缢缩，尾末端有一明显的透明区(图 1G)。

根据以上测量值及形态特征，寄生福建省台湾长果桑的根结线虫与刘维志^[10]报道的相符，初步确定其种为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)。

2.3 分子鉴定

基于以上形态测量与描述鉴定的结果，选用常见种的特异性引物Mi-F/Mi-R、Fjav/Rjav及Far/Rar分别对供试的9个台湾长果桑根结线虫样本进行特异性PCR检测。结果显示，5个台湾长果桑根结线虫样本经引物Mi-F/Mi-R扩增后均获得约1 000 bp大小的条带，以Fjav/Rjav和Far/Rar为引物则未扩增出任何条带，同时不含DNA的阴性对照也无条带(图 2)，进一步确定了寄生台湾长果桑的根结线虫为南方根结线虫。

3 讨论

线虫种类的准确鉴定是进一步研究线虫致病性、生物学及防治技术措施的基础。当前我国已报道的根结线虫有56种^[11]，根结线虫种内及种间往往受寄主和环境等因素的影响而在形态上有较大的变化。因此，单一的鉴定方法往往不可靠^[12]。根结线虫种特异性引物PCR扩增由于不受虫体发育以及周围环境的影响已广泛运用于种的快速、准确鉴定^{[11, 13]}。本研究在形态学鉴定的基础上再应用种特异性引物对采集的9个台湾长果桑根结线虫样本进行PCR扩增，一致鉴定出寄生福建省台湾长果桑的根结线虫为南方根结线虫。南方根结线虫具有广泛的寄主范围，可寄生多种植物，但台湾长果桑是我国大陆新报道的寄主。鉴于根结线虫对果桑造成的危害，今后在台湾长果桑的栽培管理中应加强预防根结线虫病的发生并进行相应的防治工作。