活性氧自由基(reactive oxide species,ROS)是生物氧化代谢产物，也是有氧生命和新陈代谢的重要组成部分。正常的生理状态下，体内ROS生成系统和内源性清除ROS的抗氧化系统处于动态平衡。由于某些因素如吸烟、辐射、环境污染等诱导，使体内ROS生成过多或清除ROS能力下降，体内氧化增强系统与抗氧化系统之间的平衡向氧化增强方向倾斜，导致体内氧化应激，造成ROS过度累积而引起蛋白质、DNA等生物大分子损伤，从而产生各种疾病，如中风、肺气肿、炎症、老年性痴呆、帕金森氏病、白内障、糖尿病、动脉粥样硬化等^{[1, 2]}。ROS主要包括超氧阴离子(O₂^-·)、羟自由基(·OH)、过氧化氢(H₂O₂)、脂质过氧化物。

抗氧化剂是指能够延缓衰老，使自由基失去活性的化合物。清除自由基和防止脂质过氧化是抗氧化活性的两种特性。目前用于医疗和食品领域的多是合成抗氧化剂，如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT)和丁基羟基茴香醚(butyl hydroxyanisole,BHA)，但两者对生物体均有一定的毒副作用。因此，从天然产物如中草药中寻找天然、高效、低毒的抗氧化剂已成为研究热点。近年研究发现，中药材中的皂苷成分(如栀子总皂苷^[3]、红景天苷^[4]、灵芝三萜皂苷^[5]和重楼皂苷^[6]等)具有抗氧化活性,可清除自由基，增强超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性，降低丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量从而抑制机体内脂质过氧化^[7]。

楮头红是一种天然药用植物，主要分布于我国的福建、台湾、四川、江西、湖北等地，具有清热解毒、保肝护肝、抗肝炎病毒等功效，在福建被广泛用于治疗肺热咳嗽、急慢性肝炎及各种炎症^{[8, 9, 10]}。本课题组研究发现，楮头红含皂苷类物质。本试验采用体外测定楮头红皂苷的还原力、清除O₂^-·自由基及抑制脂质过氧化的能力，为其临床应用研究提供依据。

楮头红皂苷，褐色粉末，经泡沫试验、乙酸酐—硫酸溶液反应和三氯乙酸反应定性检验确认为皂苷类物质，由福建农林大学福建省动物药物工程实验室提供。

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、FeCl₃、BHT、铁氰化钾、三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane,THAM]、邻苯三酚、乙二胺四乙酸、HCl、卵磷脂、硫代巴比妥酸(2-Thiobarbituric acid,TBA)、Vc，均为AR级及以上，购于国药集团化学试剂有限公司。

精确称取25 mg楮头红皂苷粉末，用蒸馏水溶解，定容于50 mL容量瓶中，配置成0.5 mg·mL^-1皂苷储备液。准确移取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL储备液于10 mL容量瓶中，定容，配制成浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg·mL^-1的皂苷工作液，备用。

准确称取50 mg BHT，用无水乙醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，配制成1 mg·mL^-1的BHT储备液。准确吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL储备液于10 mL容量瓶中定容，配置成浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg·mL^-1的BHT工作液，备用。

采用普鲁士兰法测定楮头红皂苷的总还原力^[11]，以BHT为对照(CK)。取2 mL不同浓度(0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg·mL^-1)的楮头红皂苷和BHT溶液(二者浓度相同)于具塞试管中，分别加入2.0 mL 0.2 mol·L^-1 磷酸缓冲溶液(pH 6.6 )及1%(质量比)铁氰化钾溶液，50 ℃水浴20 min后冰浴迅速冷却，加入2.0 mL 10%(质量比)三氯乙酸溶液，摇匀，离心(3 000 r·min^-1，10 min)。取上清液2.0 mL，加2.0 mL双蒸水和0.5 mL 0.1% (质量比)FeCl₃，摇匀，反应10 min后，测定D_{710 nm}。

采用邻苯三酚自氧化法测定楮头红皂苷对O₂^-·的清除率^[12]。在空白管和测定管中依次加入3.0 mL 0.05 mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液(pH=8.2)、45 μL 45 mmol·L^-1邻苯三酚(37 ℃预热)、蒸馏水和样液各1.0 mL，迅速摇匀，反应时间5 min，测定每分钟的D_{325 nm}。分别测定加入样品前后邻苯三酚每分钟光密度的增加率，计算邻苯三酚自氧化时反应速率及加入样品后的自氧化速率。楮头红皂苷对O₂^-·的清除率的计算公式如下。

O₂^-·清除率/%=(△D₀/△t-△D₁/△t) /(△D₀/△t)×100

式中，△D₀/△t为邻苯三酚自氧化反应速率；△D₁/△t为加入样品液后邻苯三酚自氧化速率。

采用TBA检测楮头红皂苷对脂质体过氧化的抑制率^{[1, 13]}。分别吸取1.0 mL卵黄悬液[600 mg卵磷脂溶于60 mL 10 mmol·L^-1 磷酸缓冲液(pH 7.4)中]、1.0 mL不同浓度(0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg·mL^-1)的楮头红皂苷和BHT溶液(CK)、 1.0 mL 0.4 μmol·L^-1FeCl₃溶液、1.0 mL 0.4 μmol·L^-1 Vc溶液于具塞空白和样品试管中，摇匀，避光，于37 ℃水浴60 min。各加入三氯乙酸—TBA—HCl混合液(15 g三氯乙酸、0.37 g TBA、2.1 mL HCl依次加入100 mL水中)2.0 mL，100 ℃水浴15 min，迅速冷却，以2 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，测量D_{532 nm}。以样品对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率(I)来表示样品的抗氧化活性能力。

I/%=(D_c-D_s)/D_c×100。

式中，I表示抑制率；D_c表示对照管的光密度；D_s表示样品的光密度。

楮头红皂苷和BHT体外总抗氧化力见图1。由图1可知，楮头红皂苷和BHT的总抗氧化力均随着浓度的增加而提高，说明浓度和还原力之间呈现显著的量效关系；当皂苷和BHT的浓度相同时，楮头红皂苷的还原力略低于BHT。

	图1 楮头红皂苷和BHT总抗氧化力 Fig.1 Total in vitro antioxidant of S.nepalensis saponins and BHT
图选项

反应2、3、4、5 min时，邻苯三酚自氧化速率分别为0.519 1、0.368 5、0.272 6、0.249 1；加入不同浓度的皂苷后，反应2、3、4、5 min时，邻苯三酚的自氧化速率见表1。由邻苯三酚自氧化速率和表1数据可计算出皂苷对O₂^-·自由基的清除率(表2)。从表2可以看出，楮头红皂苷具有清除O₂^-·的活性，随着皂苷浓度的增加，其体外清除O₂^-·自由基能力也不断增强，其浓度与O₂^-·清除率间存在显著的量效关系。当皂苷浓度为0.5 mg·mL^-1时，对O₂^-·清除率为59.33%。当皂苷浓度相同时，随着反应时间的增加，对O₂^-·清除率也有所提高。

由图2可知，在本试验的浓度范围内，皂苷对脂质体氧化的抑制能力随着浓度的增加而提高，且浓度与抑制率之间呈现量效关系。低浓度时(<0.2 mg·mL^-1)皂苷对脂质体过氧化的抑制能力显著低于BHT；浓度在0.2～0.4 mg·mL^-1之间时，皂苷与BHT对脂质体过氧化的抑制能力相差不大；当浓度达到0.4 mg·mL^-1后，皂苷的抑制能力高于BHT。

	图2 楮头红皂苷和BHT对脂质体过氧化的抑制率 Fig.2 Antioxidant activity of S.nepalensis saponins and BHT in a lecithin liposome system
图选项

邻苯三酚自氧化法操作简单、稳定性好、周期短、重现性好且灵敏度高，被广泛用于测定对O₂^-·的清除能力。邻苯三酚在碱性环境下容易发生自氧化，生成O₂^-·和一种在325 nm处有特征吸收峰的中间产物。当加入O₂^-·清除剂时，抑制O₂^-·的生成，邻苯三酚自氧化速率减慢，中间物的生成减少，在325 nm处的吸收也随着减弱^[14]。因此，可以通过测定D_{325 nm}来判定清除剂的清除能力。

TBA反应机制是不饱和脂肪酸氧化分解后生成MDA及其类似物，在受热和酸性环境下，能够与TBA试剂发生化学反应，生成一种在532 nm处有最大吸收值的粉红色的化合物，即硫代巴比妥酸反应物质(TBA reactive substance，TBARS)^[15]。在Vc的作用下，FeCl₃促进卵磷脂脂质体的脂类氧化。当加入抗氧化剂后，能抑制脂质体中TBARS的形成，随着抗氧化剂浓度增加，抑制作用也增强，在532 nm处的吸收也减弱。

本试验采用3种体外抗氧化试验模型来评价楮头红皂苷的抗氧化性。结果表明，楮头红皂苷有较强的还原能力，能够抑制脂质体过氧化，有清除O₂^-·自由基的活性。而且在各个体系中，楮头红皂苷的抗氧化活性与其浓度之间均有良好的量效关系。因此，楮头红皂苷是一种良好的天然抗氧化剂。