兜兰属(Paphiopedilum)植物是最受欢迎的兰科植物之一，具有极高的观赏价值^[1]。随着国际花卉市场对兜兰的大量需求，以及持续的采集压力致使我国野生兜兰种群数目锐减，部分兜兰在野外已极难发现^[2]。恢复兜兰种群数量是保护兜兰的有效途径之一^{[3, 4]}，然而兰科植物微小的种子本身无法贮存养分。在自然条件下其种子萌发阶段完全依靠菌根真菌为其提供养分^[5]，但人工种植过程中缺少兰科真菌的作用，制约了兰科植物种群恢复的进程^[6]。研究表明，菌根对多种植物的生长发育有促进作用，兰科植物也与特定的菌根真菌相结合而汲取养分^{[7, 8, 9]}。自然条件下，兰科菌根真菌促进种子萌发，有助于植株吸收无机养分和水分^[10]。因此，菌根真菌对兰科植物生长发育极为重要，在兰科植物人工栽培中引入菌根化育苗技术具有广阔的应用前景。

兰科菌根真菌的形态学特征与鉴定、共生关系的研究均涉及到菌根结构观察与侵染率测定。由于研究者所采用的染色方法不同^{[11, 12, 13]}，其研究结果往往缺乏可比性。因此，有必要对现有的兰科菌根染色方法进行比较和改良。本研究以同色兜兰营养根为材料，对比酸性品红、台酚蓝、苏丹红Ⅳ、苯胺蓝和墨水等5种染色剂对其菌根真菌的染色效果，以期建立高效、准确的同色兜兰菌根染色方法，为兜兰菌根研究提供基础。

同色兜兰植株采集于广西雅长兰科植物自然保护区，现保存于广西农业科学院花卉研究所兰科植物资源圃中。选择资源圃中健康植株的营养根作为试验材料。

采集同色兜兰生长良好的营养根，用已消毒的剪刀截取4-5 cm的根3-4段。在自来水下冲洗干净，切成2-3 cm的小段，用滤纸吸干水，加0.2 g·mL^-1 KOH 溶液完全浸泡根系，90 ℃分别水浴3、5、7、9 h，然后用自来水轻轻冲洗3次。用10% H₂O₂脱色5 h后用自来水冲洗3次。加2% HCl溶液室温酸化30 min，去掉HCl 溶液，用自来水轻轻冲洗3次。用5% 醋酸墨水染色，即以5 mL派克纯黑书写墨水加95 mL家用白醋配制。染色液室温过夜后，将根段放在水中保存。

用5种染色剂进行染色处理，各染色剂配制如下。①苯胺蓝染色液：0.1 g苯胺蓝+100 mL 95%酒精；②酸性品红染色液：0.15 g酸性品红+100 mL乳酸+100 mL甘油+100 mL蒸馏水；③苏丹红Ⅳ染色液：0.1 g+苏丹红Ⅳ染料+10 mL 95%酒精+10 mL甘油；④台酚蓝染色液：0.05 g台酚蓝+100 mL乳酸+100 mL甘油+100 mL蒸馏水；⑤醋酸墨水染色液：5 mL派克(Quink)纯黑书写墨水+95 mL家用白醋。各处理均采用 1.2.1 所述方法，但90 ℃水浴5 h；①-④染色后的根段在乳酸甘油溶液(乳酸∶甘油∶蒸馏水为1∶2∶1)中保存，⑤染色后的根段在蒸馏水中保存。

制片与显微镜观察 挑取脱色处理后的根段于载玻片上，加2-3滴乳酸于根系使其起褪色作用，盖上24 mm×50 mm盖玻片，用手指将根段稍用力压扁。使用奥林巴斯CX41显微镜观察和拍照。

同色兜兰菌根不同脱色时间下染色效果差异较大(图 1)。从图 1可见，3 h处理的菌根皮层杂质未消煮干净，造成皮层染色较深，反差不明显；7 h处理的菌根皮层杂质少，但部分皮层细胞破裂，染色背景杂；9 h处理的菌根皮层多数已经消煮烂，皮层细胞破裂较多，细胞内容物染色，不易进行压片观察；5 h处理的菌根皮层比较干净，杂质少，染色效果较好。

	图 1 不同脱色时间下同色兜兰菌根皮层染色效果(×10) Fig.1 Dye results of P.concolor mycorrhiza in different treatment durations
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同色兜兰菌根5种染色效果见图 2。其中，酸性品红和苏丹红Ⅳ染色方法操作简便，但是兜兰菌根真菌很难上色，仅见根皮层被染上相同或略浅的颜色，极少见菌丝着色；苯胺蓝染色效果一般，根内杂质被染上较深的颜色；台酚蓝染色效果可靠稳定，但皮层被染上相同或略浅的颜色，菌根真菌与皮层组织之间颜色反差小；墨水染色对菌根真菌的染色效果较好，能清楚地观察到菌根真菌的泡囊和菌丝着色牢固。

	图 2 同色兜兰菌根5种染色效果对比及菌根真菌形态 Fig.2 Comparison among five staining results in P.concolor mycorrhiza and mycorrhizal fungi morphology
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兰科真菌是兰科植物特有的一类菌根真菌，其在兰科植物根内具有明显的菌丝圈、菌丝团、菌丝结及菌丝消解的针状结晶等结构。墨水染色方法可以清晰地观察到兰科真菌不同时期的形态，也能够较好地染色观察到其他菌根真菌的菌丝和泡囊(图 3)。此方法适用于同色兜兰菌根真菌鉴别和侵染率统计。其他4种染色方法对兰科真菌的染色效果不理想，对其他菌根真菌的染色效果也达不到观察目的。由此可见，醋酸墨水染色方法可以较好地区分兰科真菌和其他菌根真菌。

	图 3 墨水染色同色兜兰菌根 Fig.3 Ink-vinegar stained P.concolor mycorrhiza
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对比5种染色方法的染色效果、成本、试剂毒性和根段保存时间(表 1)，墨水染色具有无毒、成本低、清晰度高、反差大和染色效果佳的特点。菌根染色后能够较好地观察不同菌根真菌形态，便于对兰科菌根真菌鉴别和侵染率的统计。

以兰科真菌为目标进行染色时，会有其他种类真菌同时被染色，这些真菌是非兰科真菌的内生真菌，与兰科真菌形态差异较大，极易区分，利用醋酸墨水染色方法可以对兜兰其他内生真菌进行观察(图 2)。酸性品红染色时，皮层被染上淡淡的红色，菌丝不能着色；用苏丹红Ⅳ染色时，仅皮层的杂质着色，看不见菌丝着色；而用苯胺蓝染色时，一般的杂质也能染上较深的颜色，无菌丝着色；用台酚蓝染色时，泡囊、菌丝都能着色，有部分杂质也着色，根皮层也染上略浅的颜色，反差不明显、不易观察；采用醋酸黑色墨水染色时，菌丝着色十分牢固，经过清水长时间浸泡脱色后，根皮层组织可以接近完全脱色，然而真菌的菌丝仍然保持鲜明的蓝色，可以通过形态特征的比较，区分兰科真菌与其他根外真菌。与此相比，酸性品红和苏丹红Ⅳ染色后，皮层组织与真菌在脱色阶段是同步脱色的，当皮层组织脱色至无色透明时，真菌菌丝的形态亦不再可辨。通过比较可知，经过墨水染色的根系，根内的菌丝等结构着色很深，与背景反差大，而且其他各种结构表现都比其他几种染色剂染色效果好。

本研究表明，醋酸墨水染色法对区分兰科真菌与其他共生真菌更有效，在观察菌丝的形态、入侵方式和统计侵染率时，可以减少误差。在醋酸墨水染色法中使用Quink黑色墨水为染色剂，既兼顾染色效果又低毒性。