2016, Vol. 62
文章信息
- 齐自慧 , 杨梦歌 , 王美玉 , 王业富 . 2016
- QI Zihui, YANG Mengge, WANG Meiyu, WANG Yefu . 2016
- TaqMan实时荧光定量PCR检测外周血中survivin
- Detection of surivin in Peripheral Blood Using a TaqMan Real-Time Fluorescent Quantitative PCR
- 武汉大学学报(理学版), 2016, 62(4): 350-354
- Journal of Wuhan University(Natural Science Edition), 2016, 62(4): 350-354
- http://dx.doi.org/10.14188/j.1671-8836.2016.04.008
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文章历史
- 收稿日期：2015-03-10
引用本文
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凋亡抑制蛋白survivin在正常成人组织中低表达或者不表达，但在肿瘤患者中会大量表达[1]，不同癌症外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)中均具有较高的survivin基因检出率[2-5].因此，survivin基因已经成为一种新的肿瘤标志物[6-9]，该基因的检测对于癌症的提前诊断、疗效评估和预后研究具有较高的临床价值.
survivin基因的检测方法多样，如放射免疫分析技术[10]、酶联免疫分析技术[11]以及化学发光免疫分析技术[12]等.这些技术都具有较高的灵敏度和特异性，但也存在不同程度的缺陷，如放射免疫分析技术需要放射性标记，不够安全，酶联免疫分析技术易出现假阳性，而化学发光免疫分析技术在研究和生产上难度较大等.PCR(聚合酶链式反应)技术具有取材量小，对病人造成的伤害小，且操作安全简便，检测快速等优点.目前，研究人员已通过PCR方法发现surivin基因能够在大多数的恶性肿瘤(如肝癌[13]、胰腺癌[14]、胃癌[15]等)中高表达.TaqMan实时荧光定量PCR技术是在普通PCR的基础上利用Taq酶5′→ 3′外切酶活性和荧光共振能量转移的原理，可对PCR反应进行实时监控，灵敏度和特异性高，检测用时短，且无需PCR后处理，避免了污染，检测样本用量少，能够实现精准定量[16].已有文献报道[17]利用SYBR Green染料法进行荧光定量PCR实验，染料法会出现非特异性结合.而TaqMan法因为探针具有特异性，不会出现非特异性扩增，特异性和敏感性也更高.目前，TaqMan荧光定量PCR法已被广泛应用于病毒、细菌的检测，如丙肝病毒[18]、轮状病毒[19]、革兰阴阳性细菌[20]等.
本实验旨在用TaqMan实时荧光定量PCR技术构建癌症患者外周血中survivin基因的检测方法.
1 材料与方法 1.1 材料、试剂及仪器材料：本实验所用样本由湖北省肿瘤医院、湖北省中医院、武汉大学附属中南医院、武汉大学校医院提供.
试剂：SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；TRNzol-A+总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)；UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；限制性内切酶EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ，Taq酶系列、RRI RNA酶抑制剂、OligodT(18) (TaKaRa 公司)；M-MLV逆转录酶(Promega公司).
仪器：ABI7500型荧光定量PCR检测仪(美国应用生物系统公司)；MJ-Mini TMPCR型扩增仪(Bio-Rad公司)；5424R型高速冷冻离心机(艾本德中国有限公司)；FR-980型凝胶成像仪(上海复日科技)；Quawell TM型超微量紫外可见分光光度计(Q5000) (北京华大中生科技发展有限公司).
1.2 实验方法 1.2.1 样品处理所有样品均按照TRIzol-A+试剂盒的使用说明提取总RNA，然后将RNA反转为cDNA.
逆转录体系为25 μL，其中：5 μL反应缓冲液，1 μL 200 U/μL M-MLV逆转录酶，1.25 μL 10 mmol/L dNTPs，2 μL随机引物OligodT(18) ，0.5 μL 40 U/μL的RNase抑制剂，10 μL RNA模板，加无RNA酶水至总体积25 μL.以上体系的反应程序为42 ℃ 1 h，60 ℃ 10 min. -20 ℃保存逆转录产物.
1.2.2 引物与探针设计通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)检索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得在多种肿瘤病人中均可检测到的野生型survivin基因(NCBI检索号:BC065497.1) 及其剪接变异体survivin-△Ex3(NM_001012270.1) ，survivin-2B(NM_001012271.1) ，survivin-2α(AY927772) 和survivin-3B(DQ227257.1) 等序列，用MEGA 4.0软件进行比对，找到保守序列.根据survivin基因保守序列进行引物探针的设计，用BeaconDesigner 7.0软件设计普通TaqMan探针及引物.所有引物探针均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成.
survivin保守序列(PCR产物共95 bp)：
5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCCTTC-TTGGAGGGCTGCGCCTGCACCCCGGAGCGG-ATGGCCGAG-3′
引物及探针序列如下：
上游引物：5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCA-3′
下游引物：5′-CTCGGCCATCCGCTCC-3′
探针：5′-(FAM)-CCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCC-(BHQ-1) -3′
1.2.3 常规PCR产物回收克隆及鉴定PCR反应体系为50 μL，其中：PCR缓冲液5 μL，25 mmol/L Mg2+ 7 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L 上下游引物各1.5 μL，模板cDNA 5 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.4 μL，加灭菌双蒸水至总体积为50 μL.PCR 反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共35个循环，之后再于72 ℃反应5 min.其产物经2%琼脂糖凝胶电泳，DNA 胶回收试剂盒回收.将回收片段克隆至PES载体上，构建重组质粒，转化入DH5α感受态细菌，在含有氨苄青霉素(Amp+) 的LB平板上进行蓝白斑筛选，提取质粒并用PCR (反应体系和反应条件同上) 鉴定,然后送上海英骏生物技术公司测序.
1.2.4 TaqMan实时荧光定量PCR反应条件为提高反应的扩增效率与灵敏度，选择1×104,1×105,1×106,1×107copies/μL 4个浓度的重组质粒为检测样品，反应体系为50 μL.首先进行条件优化：Mg2+(25 mmol/L)的加入量(μL)分别为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0；引物与探针(均为10 mmol/L)加入量(μL)分别为(1.3,0.6) ，(1.4,0.8) ，(1.5,1) ，(1.6,1.2) ，(1.7,1.4) 5个梯度.采用双因素混合水平正交实验设计实验.最后对Taq酶进行优化实验：Taq酶(5 U/μL)加入量(μL)分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0.反应过程分两个阶段，第一阶段：37 ℃ 5 min，94 ℃ 5 min；第二阶段：94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s(收集荧光)，72 ℃ 20 s，共40个循环.
通过以上优化实验确定反应体系中Mg2+、引物和探针以及Taq酶的最适用量.
1.2.5 标准曲线的建立选择1×107～1×104copies/μL 4个浓度的重组质粒为模板，在最佳反应条件下进行TaqMan实时荧光定量PCR实验，制作标准曲线.
1.2.6 重复性实验采用最优体系进行重复性实验，选择1×107～1×104 copies/μL 4个浓度梯度的重组质粒为模板，每个反应进行3次平行实验.通过扩增荧光曲线和循环阈值(Ct)计算来确定该反应重复性.
1.2.7 特异性和灵敏度实验选择1×104～1×101copies/μL的重组质粒为模板，每个质粒浓度进行3次平行实验，以出现较好的S型曲线、最大Ct值不超过35的最低浓度为检测灵敏度.
1.2.8 临床样本检测采集20例癌症患者新鲜血液和50例健康体检者的新鲜血液2 mL.所有癌症患者血液在术前采集并且未经过放化疗.其中，癌症患者包括7例肝癌患者，6例宫颈癌患者，5例胃癌患者和2例乳腺癌患者.50例无既往病史的健康者作为对照组.采血过程中为防止污染，外周血样品通过插入外围容器中的导管获得，并且丢弃最初的5 mL血液.这项研究经伦理委员会监控.
利用已优化的体系对外周血样品进行TaqMan实时荧光定量PCR实验.
2 结果与讨论 2.1 重组质粒筛选和鉴定重组质粒经常规PCR、2%琼脂糖凝胶电泳，得到95 bp的条带(图 1)，经测序结果显示，序列与1.2.2 节中最终确定的保守序列相同.
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| 图 1 重组质粒PCR产物电泳图 1：Maker；2：重组质粒PCR产物；3：阴性对照 Figure 1 PCR product Electrophoresis of the recombinant plasimd 1:Maker;2:PCR product of the recombinant plasimd;3:Negative control |
通过优化实验，50 μL反应体系的最佳反应条件为：Mg2+(25 mmol/L)7 μL，终浓度3.5 mmol/L；上下游引物(10 mmol/L)1.3 μL，终浓度0.26 mmol/L；探针(10 mmol/L)1 μL，终浓度0.2 mmol/L；Taq酶(5 U/μL)0.4 μL，终浓度2U.
2.3 标准曲线根据最佳反应条件，以1×107，1×106，1×105，1×104 copies/μL 4个浓度的重组质粒为模板，进行TaqMan实时荧光定量PCR实验，扩增曲线如图 2(A)所示，标准曲线如图 2(B)所示.标准曲线y=-3.422x+36.56，相关系数0.998，线性范围1×107~1×104copies/μL.
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| 图 2 PCR扩增曲线(A)和标准曲线(B) Figure 2 Amplification lot (A) and standard curve (B) by PCR |
重复性实验采用变异系数CV(%)进行方法重现性评价(表 1).表 1中3次循环的Ct值较为接近，且CV值均在5%以下，表明本实验方法的实验结果稳定，重复性良好.
| c/copies·μL-1 | Ct | CV/% | ||
| 1 | 2 | 3 | ||
| 1×107 | 8.43 | 8.97 | 9.69 | 3.11 |
| 1×106 | 12.44 | 12.15 | 11.79 | 3.43 |
| 1×105 | 15.37 | 15.72 | 16.38 | 4.05 |
| 1×104 | 20.76 | 20.61 | 19.45 | 4.41 |
将重组质粒作为标准品进行普通PCR扩增，然后将扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳图显示各泳道在95 bp的位置均有特异性条带出现，阴性对照无条带出现.将PCR产物测序，所测序列与靶序列完全一致，未出现非特异性扩增产物.
此外，选择浓度为1×104，1×103，1×102，1×101 copies/μL的标准品进行荧光定量PCR实验，结果如图 3所示，相对应的循环阈值如表 2所示.除1×101 copies/μL对应的曲线外，其余3条曲线的Ct值均小于35，且呈现出明显的S型.据此，本实验设定Ct值在35个循环之内，检测结果低于1×102 copies/μL的样品为阴性标本.
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| 图 3 不同浓度样本的TaqMan荧光定量PCR扩增曲线 Figure 3 TaqMan real-time PCR amplification curve of different concentrations of sample |
| c/copies·μL-1 | Ct |
| 1×104 | 27.56 |
| 1×103 | 31.18 |
| 1×102 | 34.65 |
| 1×101 | 38.09 |
目前，大多数的荧光定量PCR用的是染料法，所测survivin的最高灵敏度也可以达到1×102 copies/μL[21].但是该文献方法是一种相对定量的方法，得到的结果是相对于内参的拷贝数量.而TaqMan实时荧光定量PCR是一种绝对定量的方法，故本实验的灵敏度好.
2.6 临床样品检验结果用已建立的TaqMan实时荧光定量PCR体系检测临床外周血样品，50例健康样本中survivin检测结果为3例为阳性(占6%)，其中1例为强阳性，2例为弱阳性；20例癌症样本中survivin检测结果为15例为阳性(占75%)，5例为阴性.其中15例阳性样本包括：肝癌样本5例(占71%)，宫颈癌4例(占67%)，胃癌4例(占80%)，乳腺癌2例(占100%).
3 结论本研究运用TaqMan实时荧光定量PCR技术实现了对survivin基因的快速、灵敏地检测，且检测特异性高.在采集血液时弃去前5 mL血液，有效地解决了实验结果出现假阳性的问题.该方法操作简便，仅需抽取少量外周血，能在对病患最低伤害的情况下快速获得准确的检验结果，可望应用于临床上癌症的早期诊断、疗效评估等方面.但由于样本数量限制，本文结果还有待进一步大量临床样本进行验证.
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