武汉大学学报(理学版) 2017, Vol. 63 Issue (1): 45-50
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王加丽, 杨怡, 瞿旭东
WANG Jiali, YANG Yi, QU Xudong
理性设计提高乙醇脱氢酶LbADH的催化活性
Improvement of Catalytic Activity of Alcohol Dehydrogenase LbADH by Rational Design
武汉大学学报(理学版), 2017, 63(1): 45-50
Journal of Wuhan University(Natural Science Edition), 2017, 63(1): 45-50
http://dx.doi.org/10.14188/j.1671-8836.2017.01.005

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收稿日期：2016-03-07
Abstract              PDF              Figures              Tables
引用本文
王加丽, 杨怡, 瞿旭东. 理性设计提高乙醇脱氢酶LbADH的催化活性[J]. 武汉大学学报(理学版),2017, 63(1): 45-50.
WANG Jiali, YANG Yi, QU Xudong. Improvement of Catalytic Activity of Alcohol Dehydrogenase LbADH by Rational Design[J]. Journal of Wuhan University(Natural Science Edition), 2017, 63(1): 45-50.
理性设计提高乙醇脱氢酶LbADH的催化活性
王加丽, 杨怡, 瞿旭东    
武汉大学 药学院，湖北 武汉 430072
收稿日期：2016-03-07
基金项目：国家自然科学基金面上项目(31270119)
作者简介：王加丽, 女, 硕士生, 现从事生物合成研究. E- mail: wangjiali@whu.edu.cn
通信联系人：E- mail:quxd@whu.edu.cn
摘要：来源于革兰氏阳性短乳杆菌Lactobacillus brevis ATCC 367的乙醇脱氢酶LbADH是催化手性醇的模式酶，以四聚体的形式发挥催化活性.本研究通过计算机分子模拟进行理性设计，确定并设计LbADH中与单体间疏水相互作用及盐桥键形成相关的关键位点，通过定点突变在原始序列中引入相应的氨基酸，以改变单体间的结合能力，定向调节其催化活性和热稳定性.研究获得一个疏水突变体LbADH F146L，其在37 ℃下的酶活力为野生酶的8.5倍，在50 ℃下的酶活力为野生酶的5.6倍；其动力学参数Kcat/Km(1.99×106 L·mol-1·s-1)为野生酶(1.40×104 L·mol-1·s-1)的142倍，表明其催化效率明显提高.该研究结果表明，通过将LbADH中146位的苯丙氨酸(F146)突变为亮氨酸(L)增大疏水作用可以提高其催化活性.
关键词：乙醇脱氢酶     分子模拟     酶活力     动力学     疏水作用     理性设计    
Improvement of Catalytic Activity of Alcohol Dehydrogenase LbADH by Rational Design
WANG Jiali, YANG Yi, QU Xudong    
School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China
Abstract: Alcohol dehydrogenase LbADH from the Gram- positive bacterium Lactobacillus brevis ATCC 367 is considered as a model of biocatalyst for keto- reduction, which exerts catalytic activity as a tetramer. In this study, site- directed mutation was adopted at appropriate sites designed by computational molecular simulation- based rational design to change the hydrophobicity or salt bridges formation between LbADH monomers. Mutation in these positions can influence its catalytic activity and thermostability. A mutant enzyme LbADH F146L with higher catalytic activity was obtained. The enzyme activity of LbADH F146L was 8.5 and 5.6 times as high as that of wild type (LbADH) at 37 ℃ and 50 ℃ respectively. Kinetic parameter Kcat/Km of LbADH F146L (1.99×106 L·mol-1·s-1 ) was 142 times as high as that of wild type (1.40×104 L·mol-1·s-1), confirming its improvement of catalytic efficiency. This study showed that enzyme activity and catalytic efficiency of LbADH could be improved if phenylalanine in 146 (F146) is mutated into leucine (L).
Key words: alcohol dehydrogenase     molecular simulation     enzyme activity     kinetics     hydrophobic interaction     rational design    
0 引言

生物催化剂的应用非常广泛，包括制药、医疗、食品、农业、造纸、基础化学品、能源生产和矿业等领域.酶作为生物催化剂具有经济、环保等突出优势，但也普遍存在稳定性较低等缺点[1].常用于酶工程改造的方法包括理性设计和非理性设计.非理性设计不需要完全了解酶的结构与功能之间的关系[2, 3]，但需要筛选大量的突变体和发展高通量的筛选方法[4].而理性设计则要求对酶的催化机制和空间结构有充分的了解，通过少量的突变就可以对酶的结构进行精确调控[5].因此，在对酶的结构信息了解的基础上，理性设计具有突变率高、简单易行的优势[6, 7].

革兰氏阳性短乳杆菌Lactobacillus brevis (L. brevis)来源的乙醇脱氢酶LbADH是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADP)依赖型的短链还原酶，催化活性依赖于Mg2+[8, 9].LbADH是手性醇生物催化合成的模式酶，具有广泛的用途[10, 11].人们尝试用多种方法提高LbADH在工业应用中的催化效率，如：在对LbADH吸附固定化过程中采取逐步干燥的方法[12];LbADH在非水相体系中的反应提高酶活力[13];通过构建双相连续反应体系解决LbADH的底物不溶于水相的问题[14].但野生型LbADH稳定性较低、不耐储存的缺点，使其在工业应用中的反应速度、溶剂浓度等方面受到限制.据报道，LbADH的热稳定性对催化反应起决定性作用[15]，因此，提高LbADH的催化活性、热稳定性使其适用于工业化生产具有重要意义.前人多通过改变LbADH对辅酶的依赖性[16]或对LbADH催化体系进行改造[17, 18]来提高酶活力，但通过理性设计对LbADH进行改造来提高其活性和热稳定性的研究尚未见报道.

本研究通过分子模拟软件Discovery Studio 4.0对LbADH(GenBank登录号CAD66638)的蛋白空间结构进行分析，得出一系列与四聚体酶单体间相互作用相关的关键位点，并通过实验对这些位点进行突变，改变酶单体间的疏水作用力，影响盐桥键的形成，以期获得高活性高热稳定性的突变株.

1 实验部分 1.1 材料与仪器

材料：表达载体pET28a、表达菌株大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、L. brevis ATCC367由本实验室保存;Bradford法蛋白浓度测定试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)、卡那霉素购自上海生工生物工程技术公司，蛋白质Marker，DNA Marker，T4 DNA连接酶、高保真DNA聚合酶、各种限制性内切酶购自大连宝生物工程公司;Ni-NTA亲和层析填料购自Qiagen公司;其他试剂均为国产或进口分析纯产品.本实验中引物合成和测序工作由金唯智生物科技公司完成.

仪器：Lambda25型紫外-可见分光光度计(PerkinElmer公司)、C1000型PCR仪(BioRad公司)、GelDOC型蛋白凝胶成像仪(BioRad公司)、G:BOX F3型DNA凝胶成像仪(Syngene公司).

1.2 方法 1.2.1 氨基酸定点突变及表达载体的构建

提取L. brevis ATCC 367基因组DNA，以基因组DNA为模板，设计引物LbADH-For、LbADH-Rev扩增LbADH全长基因，两端引物上分别设计有限制性酶切位点NdeⅠ和HindⅢ(表S1).PCR获得的DNA片段经NdeⅠ和HindⅢ酶切后克隆至pET28a的相应位点，构建成N端带有多聚组氨酸标签(6×His-tag)的LbADH的表达质粒.基因的定点突变采用重叠延伸法[19]获得.首先利用For引物(表1)和pET28a上的T7终止子引物T7-Rev以上述pET8a-LbADH质粒为模板，扩增出包含突变位点的后部片段;其次利用Rev引物(表1)和pET28a上的T7启动子引物T7-For扩增出包含有突变位点的上部分段.而后再将两个DNA片段互为模板，利用T7-For和T7-Rev引物扩增出包含有相应突变位点的全长LbADH基因.最后通过NdeⅠ和HindⅢ酶切将突变基因克隆至pET28a，构建成表达载体pET28a-LbADH-K210R，pET28a-LbADH-S63V，pET28a-LbDAH-F146L，并测序验证.

表1 LbADH 定点突变所需的引物 Table 1 PCR primer sequences for site-directed mutagenesis of LbADH
引物序列(5′→3′)
K210R-ForAACGGACCCGCACGCCAATGGGCCATATCG
K210R-Rev TTGGCGTGCGGGTCCGTTGTGACATCGC
S63V-For CCAACATGATGTTTCCGATGAAGACGGCTGG
S63V-Rev CATCGGAAACATCATGTTGGAAAAATTGAATCTG
F146L-For GCAAGGCTTGGTGGGTGATCCTAGCTTAG
F146L-Rev TCACCCACCAAGCCTTCGATCGAAGACATG
T7-For ACGACTCACTATAGGGGAATTGTG
T7-Rev AAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTC
LbADH-For GCATATGTCAAACCGGTTAGATGGAAAAG
LbADH-Rev GAAGCTTATTGAGCGGTATAACCACCATCA
表选项
1.2.2 蛋白表达纯化

将表达载体分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取其单菌落接种到含有50 μg·mL-1卡那霉素的3 mL LB培养基中，于37 ℃过夜培养.取2 mL已培养好的菌转接至含有相应抗生素的500 mL LB中，37 ℃培养至光密度值OD600 nm值达到0.5时，冰上放置10 min使其冷却，加入诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷) 至0.1 mmol·L-1，16 ℃诱导18 h.离心收集菌体，用pH 7.5的破菌缓冲液(300 mmol·L-1氯化钠、5 mmol·L-1 咪唑、20 mmol·L-1 HEPES、10%甘油)清洗并重悬菌体.将均匀的菌体置于冰上，超声破碎后，离心取上清液即粗酶液与Ni-NTA柱结合，并用浓度分别为25，50，100，300 mmol·L-1的pH 7.5咪唑缓冲液洗脱，收集洗脱液.将收集的各管洗脱液进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定，低温超滤离心浓缩蛋白.

1.2.3 酶活力的测定

使用Bradford法[20]蛋白浓度测定试剂盒测定酶浓度，取牛血清白蛋白(BSA)标准品稀释10，20，40，50倍以其在595 nm下的吸光度值(A595 nm)做标准曲线.同样，将酶分别稀释5，10，20，40倍测A595 nm，根据标准曲线计算出酶浓度. 酶活力测定反应条件为：200 mmol·L-1丙酰乙酸乙酯10 μL，10 mmol·L-1 NADPH 10 μL，pH 7.5磷酸盐缓冲液970 μL，适量的酶，总体积共计1 mL.酶活力单位(U)定义为：在上述反应条件下，每min转化1 μmol 丙酰乙酸乙酯所需乙醇脱氢酶量为1个酶活力单位.

1.2.4 酶动力学的测定

酶的动力学参数测定时，NADPH的浓度保持在0.1 mmol·L-1，底物丙酰乙酸乙酯浓度在0.2~3 mmol·L-1的范围内变化.反应通过加入一定量的酶启动，检测340 nm处的特征峰吸收峰的变化.采用双倒数作图法(Lineweaver-Burk)计算动力学参数米氏常数和转换数.

2 结果与讨论 2.1 突变位点的选择

通过序列对比和晶体结构分析，选择LbADH位点63位丝氨酸(S63)、210位赖氨酸(K210)和146位苯丙氨酸(F146)进行突变，各突变位点的空间位置如图1所示.其中，K210突变为精氨酸(R)形成盐桥键突变体LbADH K210R，S63，F146分别突变为缬氨酸(V)，亮氨酸(L)形成疏水突变体LbADH S63V，LbADH F146L.从晶体结构上看，K210与149位的天冬氨酸(N149)距离为1 nm，是一个较为合适的构成盐键的距离[21].赖氨酸的NH3+的正电性不及精氨酸中的胍基，将赖氨酸突变成精氨酸后可增强正电性，从而增强四聚体酶的单体表面的盐桥键.通过序列对比，发现许多同源蛋白的63位为缬氨酸，但LbADH中该位点为丝氨酸.从晶体结构上看，S63位于蛋白内部，将S63突变为缬氨酸有利于提高蛋白的疏水作用从而提高蛋白的稳定性.位于四聚体酶的中心的F146突变为亮氨酸可增加单体间的疏水作用.虽然异亮氨酸的疏水性大于亮氨酸，但由于亮氨酸和苯丙氨酸在结构上更为相似，故将F146突变设计为亮氨酸更符合理性设计的原则.

图 1 LbADH中突变位点的空间位置 Figure 1 Spatial location of mutation sites in LbADH
图选项
2.2 乙醇脱氢酶突变株的构建及蛋白表达

以L. brevis ATCC 367基因组为模板，通过PCR扩增获得LbADH基因片段.片段经NdeⅠ，HindⅢ酶切后克隆至pET28a相应位点中，得到表达质粒pET28a-LbADH.随后以该质粒为模板，采用重叠延伸法克隆包含有LbADH K210R，LbADH S63V，LbADH F146L的全长基因片段，片段再经NdeⅠ，HindⅢ酶切连入pET28a载体，转化大肠杆菌DH5α，经PCR和测序验证获得LbADH相应位点突变的表达质粒.将验证正确的表达载体分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并纯化.将浓缩蛋白通过SDS-PAGE电泳分析，如图2所示，在29×103 bp附近出现LbADH及突变体蛋白，与预计理论大小相符.

图 2 LbADH及突变体蛋白表达的SDS-PAGE图 Figure 2 SDS-PAGE analysis of LbADH and its mutants M:Protein marker;1:LbADH;2:LbADH S63V;3:LbADH F146L;4:LbADH K210R
图选项
2.3 LbADH及突变体的酶活力分析

以具有代表性的潜手性酮丙酰乙酸乙酯作为反应底物，验证LbADH及其突变体的催化性能，然后测其粗酶液的酶活力.与LbADH比较，盐桥键突变体LbADH K210R、疏水突变体LbADH S63V的酶活力降低.而疏水突变体LbADH F146L的比活力在37 ℃的反应条件下为LbADH的8.5倍，在50 ℃下为LbADH的5.6倍(图3)，说明LbADH F146L在酶活力显著提高的同时具有一定热稳定性，在较高温度下仍能发挥生物催化功能.通过理性设计，Kim等也获得了催化活性和热稳定性同时提高的植酸酶[22].在LbADH的空间结构中，F146位于四聚体酶的内部，且在4个单体中距离较近.将F146突变为亮氨酸可增大疏水作用，有利于四聚体的形成和稳定.酶的热稳定性需要活性中心的周边区域具有一定的刚性，从而抵御高温环境的破坏[23].因此，选择理性设计的突变位点时，应在不影响酶活性中心的基础上，尽量提高其周边区域的刚性.

图 3 LbADH野生酶及突变体的比活力分析 Figure 3 Analysis of the specific activity of LbADH and its mutants
图选项
2.4 LbADH及LbADH F146L的动力学分析

对LbADH及突变体LbADH F146L粗酶液的酶活力测定结果表明，LbADH F146L的催化活性及热稳定性均显著提高.进一步研究了其动力学性能，绘制LbADH和LbADH F146L的动力学双倒数曲线(图4)，拟合得到的两个线性回归方程的相关系数R2均大于0.99，表明线性关系良好，计算得到较为精确的米氏常数Km (mmol·L-1)和转换数Kcat (s-1)的值(表2).

图 4 LbADH(A)和LbADH F146L(B)的双倒数曲线 Figure 4 Double-reciprocal courses of LbADH (A)and LbADH F146L(B)
图选项
表2 LbADH和LbADH F146L的动力学参数 Table 2 Kinetic parameters of LbADH wild type and F146L
酶Km /L·mmol-1Kcat/s-1Kcat/Km /L\5mol-1·s-1
LbADH 5.45 76.1 1.40×104
LbADH F146L 6.15 1.23×104 1.99×106
表选项

突变体LbADH F146L的Km值与野生酶相比略有提高，即突变体对底物的亲和力有所降低.文献[24]研究表明，酶活力的提高，往往伴随着酶对底物亲和性的降低，与本文结论一致.与野生酶相比，突变体LbADH F146L的Kcat/Km值为野生酶的142倍.

上述结果表明，与Schlieben等[16]的研究结果相比，本研究在不改变辅酶的基础上，大幅度提高了乙醇脱氢酶的催化效率.

3 结论

本研究使用LbADH作为催化手性醇的模式酶，并采用理性设计对其进行改造.研究中得到催化活性及热稳定性同时提高的疏水突变体LbADH F146L，其在37 ℃和50 ℃下的催化活性分别是野生酶的8.5倍和5.6倍，LbADH F146L的催化效率是野生酶142倍.

LbADH F146L催化活性提高的同时，热稳定性和催化效率也随之提高，进一步适应了工业化生产的要求.该研究结果证实了计算机模拟在理性设计中的可行性，可望为研究LbADH的结构和功能之间的关系提供理论参考.

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