最新的全球癌症统计数据显示，胃癌和结直肠癌为主的胃肠道肿瘤占全球癌症新发病例的15.3%和癌症死亡病例的17.1%^[1]。胃肠道肿瘤的发生和发展是包括癌前病变演变到癌症及转移的极其复杂的过程。环境因素、饮食习惯、肠道病毒（enterovirus，EV）和幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染及自身遗传因素等多种因素参与其中^[2]。随着高通量测序技术在胃肠道肿瘤研究中的应用，对肿瘤病因和恶性进展的研究在组织和整体细胞水平上取得一些进展，但由于肿瘤本身的异质性和周围微环境中细胞种类的多样性，整体水平上测序结果并不能精确反映不同类型细胞的状态和细胞间差异^[3]。识别肿瘤微环境中细胞间的差异有助于认识不同状态下的细胞变化，揭示肿瘤的发生和发展机制及寻找新的治疗靶点^[4]。

单细胞测序（single-cell sequencing）是在单细胞水平对细胞所包含的遗传物质进行扩增和测序，并展开相应的数据分析的技术，可以弥补传统高通量测序的局限性。单细胞测序包括单细胞基因组测序、单细胞转录组测序、单细胞表观组学测序、单细胞蛋白质组学测序和单细胞多组学测序，是以单细胞分辨率对肿瘤细胞和细胞内分子进行比较全面地扫描和分析。这与提供平均表达量的批量测序（bulk sequencing）不同，能够从不同层面来揭示细胞各个阶段的特性和功能^[5]。近年来，很多学者通过应用单细胞测序来揭示胃癌和结直肠癌的发生和发展机制，目前主要涉及的领域包括胃癌和结直肠癌的癌前病变、肿瘤来源、肿瘤细胞异质性、肿瘤免疫治疗、肿瘤微环境和肿瘤转移等。本文就单细胞测序在胃肠道肿瘤中的应用进展、局限性和未来探索方向进行述评，期望为胃肠道肿瘤的研究、诊断与治疗提供新思路。

1 单细胞测序在胃肠道肿瘤中的应用 1.1 癌前病变与肿瘤来源中的研究

在胃或结直肠组织中正常细胞演变到肿瘤细胞并获得恶性生物学行为之前有个重要的过程，即癌前病变。慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生和不同级别的异型增生等癌前病变可演变成胃癌，而在结直肠肿瘤中晚期腺瘤和息肉病尤其是家族遗传性息肉病具有潜在的致癌性^[6-7]。从不同的癌前病演变到肿瘤的过程涉及复杂的细胞类型转变和细胞内遗传物质改变，而单细胞测序在单细胞水平上能捕捉到细胞内外的变化，为胃肠道肿瘤发生机制研究提供强有力的工具。Zhang等^[8]应用单细胞测序技术对浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生和早期胃癌患者来源的5万多个细胞进行转录组测序，构建了揭示不同病变中细胞和分子特征的单细胞转录组图谱。研究发现，胃上皮黏液细胞在化生过程中更倾向于获得肠样干细胞表型，并确定了一些分子为癌前病变和早期胃癌的生物标志物，有助于胃癌早期检测和诊断。在一项Hp感染导致慢性胃炎的小鼠模型中进行的单细胞转录组测序研究显示，在胃黏液颈部细胞和主细胞转变为表达解痉多肽化生（spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia，SPEM）的细胞状态时，胃因子3（gastrokine 3，GKN3）在这个过程中高表达，可作为评估SPEM细胞状态的特异性标志物^[9]。而SPEM细胞则是胃黏膜细胞肠上皮化生、异型增生和形成胃腺癌的潜在细胞来源^[10]。

微卫星高度不稳定（microsatellite instability-high，MSI-H）结直肠癌通常具有高突变负荷，大部分起源于无蒂型锯齿状病变（sessile serrated lesion，SSL），其中SSL携带B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（B-Raf proto oncogene serine/threonine protein kinase，BRAF）突变和DNA错配修复蛋白MutL同系物1（mutL homolog-1，MLH1）高甲基化等表观遗传变化。然而微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）结直肠癌通常具有较低的突变负荷，大部分起源于癌前病变中的晚期腺瘤，其发展过程主要涉及腺瘤性结肠息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）、V-Ki-ras 2 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（V-Ki-ras 2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）和肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）等基因的突变。Chen等^[11]通过单细胞测序发现，肿瘤细胞起源的不同导致肿瘤发生突变途径存在差异。腺瘤样和齿状肿瘤的发生机制有显著区别：前者源自不断更新的干细胞中DNA复制引起的突变，而后者则源自结肠表面受到腔内刺激引起的细胞化生过程。家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis，FAP）是一种常染色体显性遗传综合征，主要由APC基因的遗传突变引起，易发展为结直肠恶性肿瘤^[12]。最近关于FAP和结直肠癌之间的关系的研究中通过单细胞转录组测序发现，FAP患者的相邻病变可能来自同一细胞，并且癌前腺瘤中发生代谢重编程，表明癌前病变中已具有癌症的代谢特征^[13]。

无论在胃癌或结直肠癌中，单细胞测序是用于发现从正常细胞到癌前病变以及发展为癌的过程中的遗传学改变的不可缺少的检测工具。

1.2 肿瘤细胞异质性中的研究

肿瘤异质性是恶性肿瘤的重要特征之一，指在肿瘤发生和发展过程中经过多次细胞分裂后，子代细胞发生遗传和分子特征的变化，导致肿瘤细胞增殖和侵袭能力、药物敏感性以及预后等各方面产生差异^[14-15]。肿瘤异质性对胃肠道肿瘤的发生、发展、转移和治疗产生重大影响。通过单细胞测序可获得有关单个细胞的基因组、转录组或其他信息，揭示肿瘤细胞之间的差异和进化关系，为研究胃肠道肿瘤异质性提供新的方法。

Zhang等^[16]的研究根据单细胞转录组测序特征确定胃癌细胞的5种亚组（C1~C5），并发现不同亚组细胞分化程度不同。该研究结果表明，胃癌细胞分化程度多样性与患者预后密切相关；低分化的胃癌细胞具有更高的侵袭性，可预测胃癌患者预后不良。另一项基于Lauren分型的单细胞测序研究显示，肠型和弥漫型胃癌具有不同的细胞群特征，并且在胃癌中同时存在处于非恶性状态、癌前病变和恶性状态的细胞亚群^[17]。在肠型胃癌细胞中发现，细胞周期素D1（cyclin D1，CCND1）突变是癌前病变演变为癌症的重要特征，而在弥漫性胃癌中发现一种独特的癌细胞群，与临床预后不良相关。除此之外，在弥漫性胃癌中也发现少量的具有肠型胃癌细胞特征的细胞群，可以解释为什么在先前的批量基因组学研究中肠型和弥漫型胃癌之间缺乏明显的差异^[17]。

从分子和临床角度来看，结直肠癌是一种高度异质性的疾病，患者之间在预后和治疗反应性方面存在显著差异，而这些差异的一部分可以通过结直肠癌中的分子多样性来解释^[18]。Bian等^[19]为了深入探索结直肠癌的肿瘤内异质性，在结直肠癌患者中进行优化的单细胞多组学测序，包括DNA、DNA甲基化和转录组测序。该研究发现，肿瘤细胞中DNA甲基化水平低于癌旁正常上皮细胞，且同一肿瘤组织中不同亚克隆细胞群的甲基化水平存在差异，说明甲基化异质性主要源于同一患者肿瘤内不同亚克隆细胞群之间的DNA甲基化差异。

在人类癌症的发展过程中，体细胞突变率的增加似乎很常见。Roerink等^[20]研究表明，结直肠癌细胞具有广泛的突变多样性，并携带比正常结肠细胞多几倍的体细胞突变，其中多数结直肠癌细胞的突变是在克隆性增殖的过程中发生。

对胃肠道肿瘤组织进行单细胞测序，根据肿瘤细胞内分子表型和细胞状态对肿瘤细胞进行分类，探究不同的细胞亚群之间的差异和特征，揭示肿瘤细胞间的相互作用，从而探索胃肠道肿瘤发展所涉及的复杂异质机制，有助于进一步明确诊断、改善预后分析和监测药物疗效。

1.3 肿瘤免疫治疗中的应用

肿瘤免疫治疗的开发基于对肿瘤逃逸机制的研究。其通过干预免疫系统调节抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤细胞免疫逃逸^[21]，已成为肿瘤治疗领域的热点。肿瘤免疫治疗针对明确的免疫相关标志物进行免疫干预，而可用于临床的生物标志物却难以确定。尽管高通量测序可寻找大量的生物标志物，但由于免疫系统的复杂性，真正可用于临床的标志物少之又少。这使肿瘤免疫治疗存在许多局限性。

单细胞测序技术可以揭示免疫复杂性并预测潜在的抗癌靶点，是研究肿瘤免疫的有力工具，在胃肠道肿瘤的免疫治疗中有极高的实用价值。有研究利用单细胞RNA测序在胃癌组织和胃癌患者外周血中均发现下调的耗竭性CD8⁺ T细胞相关的细胞因子，为免疫治疗提供潜在的治疗靶点^[22]。另有一项研究对结直肠癌患者的免疫和基质细胞进行单细胞RNA测序分析，确定特异性巨噬细胞和常规树突状细胞（conventional dendritic cell，cDC）亚群作为肿瘤微环境中细胞串扰的关键介质，并定义了一种髓系群体^[23]，揭示了这个细胞群体对髓系靶向免疫疗法反应的潜在机制。

运用单细胞测序系统化地将胃肠道肿瘤患者的免疫细胞和非免疫细胞进行对比，可以获取肿瘤细胞或免疫细胞的组合方式和基因数据。这些个性化的数据将为医师的治疗选择提供个性化证据，使医师能够有针对性地开展治疗，判断患者接受治疗后的病情发展程度及预后情况。

1.4 肿瘤微环境中的应用

肿瘤微环境作为肿瘤的重要组成部分，除了含有肿瘤细胞外还包括各种细胞类型（如免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞和脂肪细胞等）以及围绕肿瘤细胞的细胞外成分和信号分子（如周围的血管、细胞外基质、细胞因子和生长因子等）^[24]。传统测序方法不能有效识别和阐述肿瘤微环境中单个细胞的种类及其所处状态，可能掩盖许多重要的信息，而应用单细胞测序对肿瘤微环境的全面分析则为肿瘤细胞在癌组织内的生长、免疫浸润和细胞间相互作用等方面提供更为精确的细胞图像特征。免疫细胞浸润是肿瘤微环境的重要特征。肿瘤微环境中的各种免疫细胞与肿瘤细胞相互作用，介导肿瘤的免疫耐受，影响肿瘤进展和转移，从而影响免疫治疗效果^[25]。

Fu等^[22]利用单细胞测序技术对从胃癌患者中分离的T细胞进行单细胞水平上的异质性特征分析，并鉴定不同免疫细胞亚群及其异质性转录因子。与对照组比较，胃癌组织中干扰素调节因子8（interferon regulatory factor 8，IRF8）在耗竭性CD8⁺ T细胞中表达下调，并且与预后不良相关。在结直肠癌中进行的一项单细胞测序研究显示，与正常组织比较，在结直肠癌组织中T细胞和B细胞的比例和功能状态发生广泛变化^[26]。该研究发现，早期结直肠癌中的B细胞被鉴定为表达肿瘤抑制因子的前B细胞（pre-B细胞），而晚期结直肠癌中的B细胞则倾向于发展为浆细胞，并认为之前发现的B细胞在肿瘤中具有不同的作用可能是由于不同的B细胞亚型在肿瘤中扮演的角色多样性所致。Li等^[27]在胃癌中发现可能来源于单核细胞的肿瘤相关巨噬细胞亚群。这类巨噬细胞亚群在血管生成、Hedgehog（Hh）信号通路、上皮间充质转化、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路和白细胞介素10（interleukin 10，IL-10）信号转导中高度活跃，提示其在癌症免疫和恶性进展的重塑中发挥重要作用。通过单细胞测序可更好了解胃肠道肿瘤微环境中不同组分的特征及彼此之间的相互作用，为开发针对特定细胞亚群的治疗策略提供线索。

1.5 肿瘤转移研究中的应用

腹膜转移是晚期胃肠道肿瘤患者死亡的首要原因之一，其中约45%的晚期胃癌患者均会发生腹膜转移。一项研究使用单细胞RNA测序技术结合免疫组织化学染色检测出腹膜转移细胞具有高度异质性，证明Yes相关蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）在转移细胞中呈高表达且使腹膜转移细胞具有干性的功能，可作为胃癌患者发生腹膜转移的靶标^[28]。另一项研究利用腹膜转移细胞单细胞RNA测序分析，表明腹膜转移细胞转录组学特征可以预测患者的生存率，且独立于组织病理学特征^[29]。单细胞测序可以识别胃肠道肿瘤患者中侵袭转移肿瘤细胞特有的基因突变和转录组学特征，找出肿瘤发生转移的关键因子，鉴定肿瘤转移过程中的分子机制，为相关诊断生物标志物及靶向治疗药物的开发提供理论依据。

2 单细胞测序在胃肠道肿瘤中挑战

与高通量测序技术比较，单细胞测序技术能准确地揭示胃肠道肿瘤内细胞亚群，能鉴定肿瘤的异质性，探索肿瘤微环境、转移、耐药和免疫治疗疗效等作用机制，是探究胃肠道肿瘤的发生和发展机制以及防治方向的有力新型技术。然而该项技术仍存在局限性，如高额的成本、对样本质量要求较高、在制备单细胞悬液时细胞可能死亡导致质量不合格以及无法判断在制备单细胞悬液时细胞的转录状态是否发生改变和基因是否发生突变。另外，在探索细胞亚群方面，若细胞类群数量稀少，也容易被忽略，使重要信息丢失。因此如何在高通量测序过程中减少基因缺失并降低错误率和假阳性率，是优化单细胞测序技术的主要目标。

3 结语

单细胞测序技术在胃肠道肿瘤研究中具有重要的应用前景，能够揭示肿瘤内部的细胞异质性和肿瘤微环境的特征，为了解肿瘤的发生、发展、转移、耐药机制以及免疫逃逸提供新的思路。然而，目前单细胞测序技术还存在一些局限性，如样品制备、数据处理和分析的复杂性以及测序成本较高等问题。为了克服这些问题，需要改进和创新单细胞测序技术、提高样品制备的效率和数据质量、降低测序成本、简化数据分析流程并开发更好的生物信息学算法。此外，将单细胞测序与其他多组学技术相结合，如空间单细胞测序、单细胞蛋白质组学和单细胞表观基因组学，可以进一步拓展对胃肠道肿瘤的认识。总的来说，单细胞测序技术在未来胃肠道肿瘤研究中前景广阔，有助于实现个性化治疗和精准医学的目标。