2019, Vol. 34文章信息
- 罗利民, 贾勇士, 吴数强, 毕爱红
- Luo Liming, Jia Yongshi, Wu Shuqiang, Bi Aihong
- NRF2基因多态性与非小细胞肺癌放射性肺损伤的相关性研究
- Association of NRF2 gene polymorphism with radiation lung injury in patients with non-small-cell lung cancer
- 实用肿瘤杂志, 2019, 34(5): 429-433
- Journal of Practical Oncology, 2019, 34(5): 429-433
基金项目
- 浙江省医药卫生科技计划项目（2015KYB044）
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作者简介
- 罗利民(1977-), 男, 浙江杭州人, 副主任医师, 从事肺癌基础与临床研究.
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文章历史
- 收稿日期：2018-04-10
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肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一, 已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位[1]。非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)约占所有肺癌的80%，约70%的患者在就诊时已属局部晚期或出现远处转移，失去手术治疗机会，放疗为不宜手术肺癌患者的重要治疗手段[2-3]。放射性肺损伤是肺癌放疗的主要并发症之一，发生率高达15%~36%，直接影响放疗疗效及患者的生存质量[4]。然而，生存状况和放射性损伤在不同的个体中差异较大，有研究指出基因变异是个体差异的根本原因[5-7]。
大量研究表明，氧化应激在放射性肺损伤及纤维化形成中发挥着重要作用[8-10]，而核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，NRF2)是细胞调节抗氧化应激和亲电性应激反应的重要转录因子[11]。研究发现，NRF2-ARE信号通路介导内源性抗氧化应激调节，NRF2水平变化对调控肺内氧化/抗氧化平衡起重要作用。Marzec等[12]在急性肺损伤小鼠模型中发现，NRF2及其下游所表达的抗氧化酶可以保护肺组织，减轻肺损伤。然而，在放射性肺损伤患者体内是否产生NRF2基因位点突变，这些突变能否成为未来预测放射性肺损伤发生的指标，目前尚不明确。
本研究拟通过Taqman探针技术检测所有NSCLC放疗治疗患者DNA中NRF2基因上单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点的表达。同时检测血清中血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)和血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)浓度。从分子水平上探讨NRF2基因多态性与放射性肺损伤的关系，揭示NRF2基因多态性与血清学指标HO-1和SOD之间的相关性。
1 资料与方法 1.1 一般资料收集2014年12月至2016年12月杭州医学院附属人民医院经病理或细胞学确诊的不可手术的NSCLC患者80例。其中男性43例，女性37例；年龄32~78岁，中位年龄64岁。所有NSCLC患者预期生存期>6个月，KPS评分>60分，并排除既往有胸部放疗史、行肺部手术和有严重慢性支气管炎、肺气肿、肺心病或其他严重疾病的患者。入组的NSCLC患者治疗前均进行常规病史采集、体格检查及血常规检查，并参照NCI CTCAE 3.0标准对放疗前呼吸道症状进行评分[13]。该研究通过杭州医学院附属人民医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。
1.2 放疗方案与分组所有NSCLC患者均接受6 MV X线放疗(varian600CD，美国Palo Alto公司)，总剂量60~70 Gy，分次剂量2 Gy，5 d/周。采用三维适形调强放疗计划，并采用CT模拟定位。放疗20次左右，重复CT定位，依据肿瘤大小重新勾画危及器官和临近器官，制定新计划[14-16]。治疗多采用5~7野共面照射技术，双肺V20要求 < 30%，V30要求 < 20%。根据患者一般状况和肺功能，NSCLC患者接受放疗后分为放射性肺炎组和非放射性肺炎组，各40例。
1.3 肺损伤评价放疗过程中每周评价患者的肺损伤情况。治疗结束后3个月和6个月行胸部CT检查，并根据NCI CTCAE 3.0急性放射性肺损伤标准评价放射性肺损伤分级(0~5级)[17-19]。评价须有3名中高级放疗专业医师共同完成。
1.4 NRF2基因多态性的检测抽取NSCLC患者外周静脉抗凝血5 mL，利用美国Promega公司的全基因组DNA提取试剂盒提取外周血基因组。查询http://www.hapmap.org人类基因组单体型数据库，以明确中国汉族人群中NRF2基因的全部SNP位点，并用haploview 4.2.0.0软件，以最小等位基因频率≥5%，两点间的R2≥0.8标准进行筛选。PCR操作过程在ABI PRISM 7300 Sequence Detection System (美国Applied Biosystems公司)完成。采用的Taqman探针序列见表 1。
| SNP ID | 序列 | Tm | 内切酶 |
| NRF2 rs6721961 | F 5′-GAAAGGCGTTGGTGTAGGAG-3′ | 58℃ | Ngo M Ⅳ |
| R 5′-GAATGGAGACACGTGGGAGT-3′ | |||
| NRF2 rs718168 | F 5′-AGTTTAGTGTCTCCCAGTGT-3′ | 56℃ | Rsa Ⅰ |
| R 5′-CTTAGTTTTCTTGTATCCGT-3′ | |||
| NRF2 rs35652124 | F 5′-CCTTGCCCTGCTTTTATCTC-3′ | 58℃ | BseR Ⅰ |
| R 5′-CTTCTCCGTTTGCCTTTGAC-3′ | |||
| 注 SNP：单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)；NRF2：核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid-2-related factor 2)；Tm：熔解温度(melting temperature)；F：正向引物；R：反向引物 | |||
放疗前、后抽取NSCLC患者外周静脉血5 mL，分离血清。采用分光光度计检测血清HO-1活性，采用化学比色法测定血清SOD含量。
1.6 统计学分析应用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理。计数资料采用频数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验。计量资料采用均数±标准差( x±s)表示，组间比较采用t检验或方差分析。应用拟和优度χ2检验计算基因型分布是否符合Hardy-Weinburg(H-W)平衡。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 总体情况放射性肺炎组40例患者，年龄32~76岁，中位年龄62岁；男性22例(55.0%)，女性18例(45.0%)。非放射性肺炎组40例，年龄39~78岁，中位年龄64岁；男性21例(52.5%)，女性19例(47.5%)。两组在年龄、性别、吸烟史和病理分型方面比较，差异均无统计学意义(均P＞0.05，表 2)。
| 临床病理特征 | 放射性肺炎组 | 非放射性肺炎组 | P值 |
| 性别 | 0.72 | ||
| 男 | 22(55.0) | 21(52.5) | |
| 女 | 18(45.0) | 19(47.5) | |
| 年龄 | 0.16 | ||
| ＜45岁 | 17(42.5) | 19(47.5) | |
| ≥45岁 | 23(57.5) | 21(52.5) | |
| 吸烟史 | 0.33 | ||
| 有 | 14(35.0) | 16(40.0) | |
| 无 | 26(65.0) | 24(60.0) | |
| 病理类型 | 0.28 | ||
| 鳞癌 | 21(52.5) | 23(57.5) | |
| 腺癌 | 19(47.5) | 17(42.5) |
NSCLC患者放疗后血清SOD及HO-1水平均升高[(228.8±40.5) μg/L vs (180.6±30.4) μg/L，(9.47±1.05) ng/mL vs (4.83±1.23) ng/mL, 均P＜0.05]。放疗后，放射性肺炎组血清SOD及HO-1水平均高于非放射性肺炎组[(255.3±60.2) μg/L vs (210.8±53.2) μg/L，(10.04±2.33) ng/mL vs (7.83±1.75) ng/mL, 均P＜0.05]。
2.3 NRF2基因多态性与NSCLC患者放射性肺损伤的相关性NSCLC患者中3个多态位点NRF2 rs6721961、NRF2 rs718168和NRF2 rs3565212的分布频率分别是90.1%、42.3%和51.4%，3个多态性位点的分布均符合H-W平衡分布(均P＞0.05)。选择分布频率最高的NRF2 rs6721961基因型进行研究，分析对比非放射性肺炎组与放射性肺炎组中NRF2 rs6721961基因型分布情况。两组NRF2 rs6712961位点C和A等位基因频率分布均符合H-W遗传平衡定律，说明符合群体代表性。两组NRF2 rs6712961基因AA基因型比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)，A等位基因频率差异具有统计学意义(P＜0.05，表 3)。
| 基因型 | 放射性肺炎组 | 非放射性肺炎组 | χ2值 | P值 | OR(95%CI) |
| CC | 9(22.5) | 11(27.5) | 7.142 | 0.061 | 0.542(0.324~0.754) |
| CA | 12(30.0) | 14 (35.0) | 3.245 | 0.076 | 0.520(0.372~0.83) |
| AA | 16(40.0) | 9 (22.5) | 8.947 | 0.031 | 0.718(0.490~1.326) |
| C | 25(62.5) | 27 (67.5) | 4.256 | 0.064 | 0.540(0.268~0.754) |
| A | 32(80.0) | 26(65.0) | 9.872 | 0.016 | 0.780(0.540~1.537) |
与非放射性肺炎组比较，放射性肺炎组各基因型血清HO-1及SOD水平均较高(表 4)。放射性肺炎组AA型患者血清HO-1水平高于CC型与CA型(均P＜0.05)，AA型患者血清SOD水平高于CC型(P＜0.05)。
| 指标 | NRF2 rs6721961 | ||
| CC | CA | AA | |
| 血清 HO-1(ng/mL) |
|||
| 放射性肺炎组 | 6.93±1.57 | 7.81±0.94 | 9.64±1.63*# |
| 非放射性肺炎组 | 6.02±1.85Δ | 5.92±1.55Δ | 6.72±1.83Δ |
| 血清 SOD(μg/L) |
|||
| 放射性肺炎组 | 224.9±32.5 | 240.3±45.2 | 248.3±50.7* |
| 非放射性肺炎组 | 200.5±44.2Δ | 215.7±50.3Δ | 209.2±47.2Δ |
| 注 HO-1：血红素加氧酶1(Heme oxygenase-1)；SOD：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)；*与CC型比较，P＜0.05；#与CA型比较，P＜0.05;Δ与放射性肺炎组比较，P＜0.05 | |||
肺癌尤其是非小细胞肺癌患者行放疗常发生放射性肺损伤，不仅对患者的预后及生活质量造成很大的威胁，同时影响局部肿瘤的控制效果。放射性肺损伤常见的表现形式是急性放射性肺炎。典型的放射性肺炎一般发生在放疗期间或放疗后1~3个月，发生肺组织充血、水肿和肺泡纤维蛋白渗出增多等，其临床表现与一般肺炎几乎无特殊差别。
NRF2是集体内氧化应激反应重要的转录活化因子，在氧化应激反应中具有重要地位[7]。NRF2参与肺气肿小鼠肺内对抗体氧化应激过程[8]。另外，NRF2参与解毒途径、氧化和抗氧化多个基因如HO-1和SOD等的调控[9-10]。HO-1是一种至关重要的细胞保护蛋白，可以被活化的NRF2激活。HO-1被证实可以保护一些氧化相关的疾病如动脉粥样硬化、肾脏损伤与肺损伤[11-13]。Marrot等[14]研究发现，HO-1在保护黑素细胞抵抗氧化应激中发挥重要作用。在对急性肺损伤疾病及胃炎这些氧化应激相关疾病中证实，位于NRF2调控区的NRF2 rs35652124位点及NRF2 rs6721961位点的基因多态性与疾病易患性关联[15]，提示Nrf2基因的多态性可能会影响NRF2功能和相关代谢基因的表达，从而影响肺组织的抗氧化性，增加肺损伤的风险。因此，探讨NRF2基因多态性是否与NSCLC放射性肺损伤及其氧化应激状态有关具有一定的临床意义。
本研究从分子水平上探讨NRF2基因多态性与NSCLC患者放射性肺损伤、血清HO-1及SOD水平的关系。结果发现，NRF2 rs6721961、NRF2 rs718168和NRF2 rs3565212多态位点在NSCLC患者分布均符合H-W遗传平衡定律，说明符合群体代表性。其中，NRF2 rs6721961的分布频率最高，约为90%，表明NRF2 rs6721961位点与NSCLC具有一定的相关性。因此，分析比较非放射性肺炎组与放射性肺炎组中NRF2 rs6721961位点不同基因型与血清中HO-1及SOD的活性水平的关系。结果显示，NRF2 rs6721961位点各基因型NSCLC放射性肺炎患者血清HO-1及SOD水平均升高，但仅AA基因型差异具有统计学意义(P＜0.05)，表明NRF2单个基因型的变异可能通过调控下游靶基因HO-1及SOD的基因转录影响其蛋白质水平的变化。该结果表明，NRF2基因多态性在一定程度上影响NSCLC放射性肺炎患者的氧化应激状态。
综上所述，本研究提示NRF2基因多态性与放射性肺损伤有一定的相关性，并对NSCLC放射性肺损伤患者肺内抗氧化功能具有调控作用，为放射性肺损伤的病因学研究提供指导依据，并为进一步分析NRF2基因多态性与NSCLC放射性肺损伤患者的预后情况奠定基础。
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