2021, Vol. 36文章信息
- 杨清, 杨海松, 张世泳, 张萌萌, 朱文龙, 邸广升, 杨森果, 张苗
- Yang Qing, Yang Haisong, Zhang Shiyong, Zhang Mengmeng, Zhu Wenlong, Di Guangsheng, Yang Senguo, Zhang Miao
- miRNA-27a在人乳腺癌MCF-7/ADR细胞株中的表达及其对细胞耐药的影响
- Expression of miRNA-27a in human breast cancer MCF-7/ADR cell line and its effect on cell resistance
- 实用肿瘤杂志, 2021, 36(1): 28-32
- Journal of Practical Oncology, 2021, 36(1): 28-32
基金项目
- 贵州省科技厅联合基金资助项目[黔科合LH字（2017）7182号]；贵阳市科技局基金资助项目[筑科合同（2018）1-89]
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通信作者
- 杨海松，E-mail: yanghaisong609@sina.com
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文章历史
- 收稿日期：2020-09-16
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2. 黔东南州人民医院甲乳外科，贵州 凯里 556000
2. Thyroid and Breast Surgery, Qiandongnan People's Hospital, Kaili 556000, China
中国女性恶性肿瘤中乳腺癌发病率居前列。由于乳腺癌在发病早期即可发生转移，乳腺癌已发展成导致许多女性早期死亡的恶性肿瘤[1]。尽管乳腺癌的综合治疗已经有了很大的进步，但乳腺癌的化疗耐药仍然是很多早期治疗失败的原因之一[2]。其中肿瘤药物的多药耐药（multidrug resistance，MDR）机制是导致肿瘤耐药的主要原因[3]。
microRNAs（miRNAs）是内源性非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA），含有20~23个核苷酸，介导基因转录后调节，参与几乎所有的生物学过程，包括细胞增殖、凋亡、分化、应激反应和细胞周期调控等[4-6]。miRNA-27a可以调节肿瘤细胞的生长、增殖、迁移、侵袭和血管生成[7-8]。调控miRNA-27a的表达可以影响三阴性乳腺癌中多药耐药蛋白转运体P-glycoprotein（P-gp）的表达[9]。P-gp是一种ATP性依赖细胞膜蛋白，主要作用是泵出细胞内的药物。该蛋白的高表达导致细胞外排药物的能力增强，药物作用浓度降低，最终降低药物对细胞的杀伤作用[10]。在已耐药的乳腺癌细胞MCF-7/Adriamycin（MCF-7/ADR）中miRNA-27a和P-gp的联系尚未有研究。本研究主要探究miRNA-27a在人类乳腺癌耐药和非耐药细胞中的表达水平及上调miRNA-27a后P-gp蛋白和mRNA表达水平的变化，为乳腺癌临床诊疗提供理论基础及潜在的分子靶点。
1 材料与方法 1.1 材料人乳腺癌多柔比星耐药细胞株MCF7/ADR购自上海美轩生物科技有限公司；人乳腺癌细胞株MCF-7受赠于贵州医科大学附属医院临床研究中心周定安博士；miRNA-27a模拟物（mimics）购自中国上海吉玛制药技术有限公司；miRNA-27a和P-gp引物购自上海吉玛制药技术有限公司；RPMI 1640和DMEM培养液以及澳洲胎牛血清购自美国GIBCO公司；RNA提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；反转录试剂盒和Real-time PCR（RT-PCR）试剂盒购自日本TaKaRa公司，P-gp抗体购自美国Abcam公司；内参抗体购自杭州贤至生物科技有限公司；山羊抗兔二抗购自北京普美生物；细胞/组织快速裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、一抗稀释液、二抗稀释液和封闭液购自上海碧云天生物技术公司；彩虹245广谱蛋白marker购自北京索莱宝科技有限公司；lipofectamine 3000购自美国赛默飞公司。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养人乳腺癌细胞株MCF-7用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液培养；耐药细胞株MCF-7/ADR用含10%胎牛血清、1%双抗和1 000 ng/mL多柔比星的PRMI 1640培养液，置于37℃5%CO2培养箱中培养，根据细胞生长情况，隔天换液，3~4 d传代。
1.2.2 RT-PCR检测细胞中miRNA-27a和P-gp mRNA表达水平分别收集MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞，用MiPure Cell/Tissue miRNA Kit提取细胞总RNA，测量RNA浓度，去除DNA，反转录成cDNA（操作按TaKaRa试剂盒说明书进行，miRNA-27a cDNA合成过程中采用miRNA-27a RT特异性颈环引物构建反转录体系），反应条件为：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃无限循环。以cDNA为模板，利用P-gp和miRNA-27a特异性引物分别进行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，共40个循环。P-gp和miRNA-27a相对表达量采用2-ΔΔct方法进行计算。
1.2.3 Western blot检测细胞中P-gp蛋白表达水平收集MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂），待细胞在冰上充分裂解（约3~5 min）后，将裂解液移至1.5 mL离心管中，10 000 r/min 4℃离心5 min。吸取上清液装于1.5 mL离心管中，BCA试剂盒检测其蛋白浓度。备8%SDS-PAGE，SDS-PAGE电泳：80 V跑浓缩胶60 min；120 V跑分离胶120 min，转膜：120V 150 min，封闭60 min，敷一抗4℃过夜，二抗室温孵育1 h，ECL发光显影；ImageJ软件分析条带灰度值。
1.2.4 细胞转染接种MCF-7/ADR细胞于6孔板内，密度为10×104个/孔，培养液不加抗生素，待细胞生长至70%融合度时，按照lipofectamine 3000说明书转染miRNA-27a模拟物和阴性对照，48 h后提取RNA进行RT-PCR实验，72 h收集蛋白进行Western blot实验。
1.2.5 细胞划痕实验接种MCF-7/ADR细胞于6孔板，密度为60×104个/孔，置于37℃ 5%CO2培养箱中。次日用200 μL型的枪头紧贴直尺板垂直于背后的1条横线划痕。PBS轻柔洗涤细胞3次，洗去所有悬浮细胞，转染miRNA-27a模拟物和阴性对照，加入无血清且无双抗的培养液2 mL。置于37℃5%CO2培养箱培养。0、24、48和72 h拍照观察，ImageJ软件分析划痕距离。
1.3 统计学分析所有实验重复3次，应用GraphPad Prism 7.0进行数据分析。组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中miRNA-27a和P-gp mRNA的差异表达RT-PCR结果显示，MCF-7细胞中miRNA-27a表达量高于MCF-7/ADR细胞，而P-gp mRNA表达量低于MCF-7/ADR细胞，差异均具有统计学意义（均P < 0.05，图 1）
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| 注 A：miRNA-27a在MCF-7及MCF-7/ADR细胞中的表达情况；B：P-gp mRNA在MCF-7及MCF-7/ADR细胞中的表达情况；** 与MCF-7细胞比较，P < 0.01 图 1 miRNA-27a及P-gp mRNA在MCF-7及MCF-7/ADR细胞中的表达情况 Fig.1 The mRNA expression levels of miRNA-27a and P-gp in MCF-7 and MCF-7 /ADR cells |
Western blot结果显示，与MCF-7细胞比较，P-gp在多柔比星耐药细胞株MCF-7/ADR中的表达量增加，差异具有统计学意义（P < 0.05，图 2）。
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| 注 ** 与MCF-7细胞比较，P < 0.01 图 2 P-gp蛋白在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中的表达 Fig.2 The expression of P-gp protein in MCF-7 and MCF-7/ADR cells |
转染miRNA-27a模拟物至MCF-7/ADR细胞中，RT-PCR检测显示，与阴性对照组比较，转染miRNA-27a模拟物后miRNA-27a的表达增高（P < 0.05），而P-gp mRNA的表达降低（P < 0.05，图 3）
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| 注 A：miRNA-27a在转染阴性对照和miRNA-27a模拟物的MCF-7/ADR细胞株中的表达情况；B：P-gp mRNA在转染阴性对照和miRNA-27a模拟物的MCF-7/ADR细胞株中的表达情况；*与阴性对照比较，P < 0.05；** 与阴性对照比较，P < 0.01 图 3 miRNA-27a及P-gp mRNA在转染miRNA-27a模拟物的MCF-7/ADR细胞株中的表达情况 Fig.3 miRNA-27a and P-gp mRNA expression levels in MCF-7/ADR cells transfected with miRNA-27a mimics |
向MCF-7/ADR细胞转染miRNA-27a模拟物，RT-PCR检测转染成功，Western blot法检测转染后P-gp蛋白的表达显示，与阴性对照组比较，转染miRNA-27a模拟物后，P-gp蛋白的表达降低，差异具有统计学意义（P < 0.05，图 4）
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| 注 *与阴性对照比较，P < 0.05 图 4 Western blot法检测MCF-7/ADR细胞转染miRNA-27a模拟物后P-gp蛋白的表达情况 Fig.4 Western blot detection of P-gp protein expression in MCF-7/ADR cells after transfection with miRNA-27a mimics |
划痕实验显示，转染miRNA-27a模拟物后MCF-7/ADR细胞的迁移能力减弱（P < 0.05，图 5）
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| 注 *P < 0.05 图 5 细胞划痕实验检测转染miRNA-27a模拟物后MCF-7/ADR细胞的迁移能力 Fig.5 Cell scratch detection of migration ability of MCF-7/ADR cells after transfection with miRNA-27a mimics |
乳腺癌若早发现、早诊断和早治疗，5年生存率可达90%以上。乳腺癌的治疗从最初的手术治疗发展到现在的全身化疗、局部放疗、内分泌治疗和靶向治疗等的精准治疗，但仍面临着复发、转移和化疗耐药的难题。目前，在MCF-7/ADR细胞中对miRNA-27a的研究尚少，其对耐药的具体作用及其机制尚不明确。miRNA-27a是miRNA-27家族的组成部分之一，有报道称miRNA-27a位于19号染色体上，在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。在乳腺癌中，上调miRNA-27a促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能是通过负调控SFRP 1来激活Wnt/β-catenin信号通路[11]。研究发现，上调miRNA-27a能够提高MCF-7细胞的增殖、侵袭和迁移能力，其机制可能与促进PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达有关[12]。而在子宫颈癌中的研究发现，上调miRNA-27a能够抑制子宫颈癌细胞体外迁移和侵袭能力，其机制可能与抑制MMP-2和MMP-9表达有关[13]。因此miRNA-27a在肿瘤细胞中是起促进还是抑制作用仍无定论。同时，越来越多的证据支持miRNA-27a在调节多态性、肿瘤发生、增殖、凋亡、侵袭、迁移和血管生成中发挥重要作用[14]。
P-gp是ATP结合盒家族转运体（ATP-binding cassette transporters，ABC）家族的一员，与肿瘤的耐药密切相关[15-16]。当P-gp过表达时，肿瘤细胞将会对大量的结构与功能不同的抗肿瘤药物产生耐药[17]。抗肿瘤药物可通过诱导凋亡来杀伤肿瘤细胞，P-gp还具有抑制肿瘤细胞凋亡的作用，这说明肿瘤耐药与细胞凋亡之间存在联系[18]。
本研究显示，上调miRNA-27a后，MCF-7/ADR细胞中的P-gp的相对表达量减少，且抑制细胞的迁徙能力，证明miRNA-27a对P-gp的表达起抑制作用。这与李济馨等[13]在子宫颈癌中的研究结果一致。但本研究为体外细胞实验，后期本课题组将从动物实验方面探究上调miRNA-27a对体内乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响及其相关的分子机制，从而为乳腺癌的靶向治疗提供科学依据。
综上所述，与MCF-7细胞比较，miRNA-27a在MCF-7/ADR细胞中呈低表达，上调miRNA-27a的表达抑制MCF-7/ADR细胞的迁移能力，提示miRNA-27a通过抑制P-gp的表达水平逆转MCF-7/ADR细胞对多柔比星的耐药性。miRNA-27a在乳腺肿瘤中是潜在的生物标志物和治疗靶点。
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