胃癌是全世界常见的恶性肿瘤之一，发病率约11.1/10万，位居恶性肿瘤第4位，死亡率位居第3位，在东南亚国家更为常见，而在我国位居消化道恶性肿瘤死亡率之首，多数早期胃癌无明显症状，发现时多为进展期胃癌，严重影响患者生存预后^[1-4]。

研究发现，泛素E3连接酶膜相关锌指蛋白2（membrane-associated RING CH 2，MARCH2）属于MARCH家族，主要定位于内质网，约含有246个氨基酸，包含1个RING结构域，可参与免疫调节、膜运输、细胞运输、DNA修复和信号转导等多种细胞活动^[5-8]。MARCH2与人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）感染相关^[9-10]，MARCH2在肿瘤方面的研究较少，与卵巢癌^[11-12]、结直肠癌^[13]和胰腺癌^[14]密切相关。本研究探讨MARCH2在胃癌侵袭转移中的作用^[15]，为胃癌临床治疗提供分子靶点依据^[16]。

1 资料与方法 1.1 材料

胃癌细胞株BGC823、人胚肾细胞293T和胃癌组织来自中南大学湘雅医学院附属海口医院。RPMI 1640培养液和胎牛血清来自以色列BI生物公司。0.25%胰酶来自美国Life公司。MARCH2多克隆抗体来自美国Abcam公司。β-actin单克隆抗体来自广州中杉金桥公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒及蛋白浓度测定试剂盒来自美国Bioword公司。5×SDS蛋白上样缓冲液、ECL化学发光液和全蛋白提取试剂盒来自江苏凯基生物科技有限公司。Matrigel基质胶及Boyden小室来自美国BD公司。CCK-8试剂来自日本同仁公司。TRIzol试剂、反转录试剂盒和荧光定量试剂均来自北京TaKaRa公司。4~6周雄性裸鼠来自南方医科大学实验动物中心。低温离心机和分光光度计来自美国Thermo公司。酶标仪来自美国BIO-BRAD公司。电泳仪来自北京AYGENE公司。MARCH2干扰质粒及慢病毒包装试剂盒来自广州复能公司。

1.2 胃癌组织相关资料

收集中南大学湘雅医学院附属海口医院病理科2013年1月至2015年12月40例胃癌患者手术标本，所有标本均包括胃癌组织与正常组织（距癌组织5 cm的正常组织），其中男性26例，女性14例，年龄37~58岁，中位年龄47.5岁；中、高分化28例，低分化12例；肿瘤直径≤5 cm 9例，> 5 cm 31例；淋巴结有转移27例，无转移13例；浸润深度：黏膜下层10例，浆膜层30例。

1.3 随访

电话随访所有胃癌患者术后生存情况。随访时间7~60个月，中位随访时间27.5个月。失访0例。

1.4 细胞培养

人胃癌细胞株BGC823和人胚肾细胞293T采用含10%胎牛血清RPMI 1640培养液培养，置于37℃ 5%CO₂培养箱，选择状态佳细胞株用于实验。

1.5 MARCH2干扰稳定株构建

提前2 d铺293T细胞于75 cm²培养瓶中，融合度达到70%左右后，把细胞培养液换成空培（无血清的RPMI 1640培养液）。BGC823/shMARCH2组吸取2.5 μg MARCH2干扰质粒和5 μL HIV包装质粒混合物置于1.5 mL无菌EP管。BGC823/NC组吸取2.5 μg空载质粒载体和5 μL HIV包装质粒混合物置于1.5 mL无菌EP管。两组分别吸取Opti-Mem液至总体积200 μL，混匀，吸取15 μL EndoFection转染试剂于无菌1.5 mL EP管，用Opti-Mem补充体积至200 μL，混匀，将这200 μL混合液全部对应加入前1支1.5 mL EP管，混匀，静置10~25 min。再把上述两组混合液各自加入已经铺好293T细胞培养瓶中，各加入总体积1/500的TiterBoost^TM增强剂。置于细胞培养箱内培养8~14 h后，用5%血清RPMI 1640培养液换液（内含有双抗1∶100配制），继续置于细胞培养箱，48 h后收集病毒上清，900 r/min离心4 min，留取上清液，并将上清液置于0.45 μm滤过膜进行过滤，收集滤液，于-80℃保存备用。前1 d铺BGC823细胞于6孔板中，细胞密度约为70%，第2天弃掉6孔板里BGC823细胞培养液，改为已收集好的两组病毒上清，加入1~2 mL/孔，置于细胞培养箱内培养36 h，然后用含5%血清RPMI 1640培养液（内含有双抗1∶100配置）换液，继续培养至细胞铺满，然后用含有嘌呤霉素的培养液进行药筛，直至对照组的细胞全部死掉，最后将实验组存活下来的细胞进行扩大培养。

1.6 荧光定量PCR

细胞总RNA提取：细胞长满瓶底，加入TRIzol试剂冰上裂解，4℃ 12 000 r/min离心15 min，上层水相转移至去酶1.5 mL离心管，沉淀RNA中加入等体积异丙醇，室温静置10 min，4℃ 12 000 r/min离心10 min，收沉淀，75%乙醇洗涤，离心，室温至干燥，适量DEPC水溶解RNA，测RNA浓度。组织总RNA提取：研钵置180℃烤箱烘烤5 h，冷却备用，研钵中加入适量的液氮，绿豆大小组织研磨成粉状，加1 mL TRIzol裂解，余步骤同前。反转录反应：按照TaKaRa反转录试剂盒说明书配制反应体系，于PCR仪中37℃反应15 min，85℃灭活5 min，取反转录产物，用DEPC水稀释至4倍，-20℃保存。荧光定量PCR反应：MARCH2荧光定量PCR引物序列上游引物为5’CCGGAATTCATGACGACGGGTGACTGC3’，下游引物为5’CGCGGATCCCGTACTGGTGTCTCCTCTGCCA3’。按照TaKaRa RT-PCR试剂盒说明书配制反应体系，实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）仪中95℃预变性10 min，95℃15 s，60℃约30 s，72℃34 s，共40个循环。取各模板Ct值，用Folds=2^-ΔΔCt值代表实验组及对照组基因表达。

1.7 Western blot

BCA法测蛋白浓度测定，利用酶标仪器测570 nm处吸光度值（absorbance，A值），计算蛋白浓度。配制10% SDS-PAGE分离胶和5% SDS-PAGE浓缩胶，每个泳道上样量40 μg，跑胶，根据Marker位置切目的条带，冰上转膜，目的条带封闭1 h，一抗4℃孵育过夜。第2天目的条带复温，加入HRP标记抗兔二抗，室温孵育约1 h，PBST洗膜。化学发光仪发光。

1.8 CCK8细胞增殖实验

选用状态良好癌细胞进行实验，消化细胞株进行铺板，每孔1×10³个细胞接种至96孔板，每孔体积100 μL，每组5个目的复孔，1个空白对照孔，37℃ 5%CO₂培养箱培养7 d。铺板24 h后开始测A值，检测450 nm处各孔A值，A值比值代表细胞增殖能力，每组取5个复孔平均值，连测7 d，绘制增殖曲线。

1.9 Boyden小室细胞侵袭实验

选取状态良好的癌细胞进行实验，小室预处理：滤膜铺胶，用RPMI 1640培养液稀释的Matrigel基质胶（1∶5混合），50 μL/小室，置于超净台紫外照射2 h杀菌，消化细胞并计数，上室中加入200 μL细胞悬液（细胞数200×10³个），下室中加入600 μL约10%胎牛血清RPMI 1640培养液。37℃5%CO₂培养箱培养48~72 h，取出小室，清洗、固定并染色。显微镜下计数穿过膜细胞数，200倍光学显微镜下随机选取上、下、左、右和中心5个视野，拍图，取5个视野细胞数均值。

1.10 裸鼠体内肺转移实验

取4~6周雄性裸鼠随机分两组，每组5只，消化细胞并计数，每只裸鼠经尾静脉注射约5×10⁶个细胞，约1个月左右观察肺脏肿瘤转移情况，肺脏标本常规固定、取材、包埋并制作石蜡切片，镜下观察肿瘤细胞肺转移情况。

1.11 统计学分析

采用Graphpad Prism 6统计软件分析数据。两组均数间比较采用配对样本t检验，多组均数间比较采用析因方差分析。采用Kaplan-Meier曲线分析生存情况。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 胃癌组织中MARCH2 mRNA表达上调

RT-PCR检测40例配对新鲜胃癌组织中MARCH2的mRNA表达。与周围正常胃黏膜组织比较，胃癌组织中MARCH2 mRNA高表达28例（高表达组），低表达12例（低表达组）。与周围正常胃黏膜组织比较，胃癌组织中MARCH2的mRNA表达水平上调（P < 0.05，图 1）。

2.2 MARCH2的表达与胃癌患者生存时间的相关性分析

利用Graphpad Prism 6统计软件进行Kaplan-Meier生存曲线分析MARCH2表达水平与胃癌患者生存时间的关系。40例胃癌患者中，MARCH2 mRNA高表达组和低表达组中位生存时间分别为30个月和43.5个月，差异具有统计学意义（P < 0.05，图 2）。

2.3 Western blot及RT-PCR检测慢病毒转染效率

Western blot及RT-PCR检测MARCH2慢病毒载体转染BGC823细胞后MARCH2水平，结果显示，与BGC823/NC组比较，BGC823/shMARCH2组的MARCH2蛋白及mRNA水平均下降（均P < 0.05，图 3~4)。

2.4 MARCH2沉默对胃癌细胞增殖能力的影响

利用CCK8细胞增殖实验检测MARCH2沉默后胃癌细胞BGC823培养7 d的增殖能力显示，与BGC823/NC组比较，BGC823/shMARCH2组细胞株细胞增殖能力在第3、4、5、6和7天均下降，差异均具有统计学意义（均P < 0.01，图 5）。

2.5 MARCH2沉默对胃癌细胞侵袭能力的影响

与BGC823/NC组比较，BGC823/shMARCH2组穿过小室膜细胞数目减少（t=13.13，P < 0.01），胃癌细胞侵袭能力减弱（图 6）。

2.6 MARCH2沉默对胃癌细胞体内肺转移能力的影响

与BGC823/NC组比较，BGC823/shMARCH2组肺脏转移灶的数目减少（t=8.954，P < 0.01），胃癌细胞体内肺转移能力减弱（图 7）。

3 讨论

胃癌发病年龄趋于年轻化，多数早期胃癌无明显症状，发现时多为进展期胃癌，严重影响患者生存预后。MARCH家族是一个结构上相关联的蛋白家族。MARCH家族11个成员，结构特点为由N端的环指蛋白（RING-CH）结构域和紧连的C端2个或多个跨膜区组成^[17]。这种跨膜RING-CH指蛋白具有多种生物学功能，如免疫调节、蛋白质控和膜运输等。MARCH2与HIV-1感染相关，在肿瘤方面，MARCH2与卵巢癌、结直肠癌和胰腺癌等密切相关。MARCH2在胃癌中的生物学作用至今未报道。

本研究通过荧光定量PCR检测发现，MARCH2在胃癌组织中mRNA高表达，Kaplan-Meier生存曲线显示，MARCH2高表达胃癌患者预后较差。构建沉默MARCH2胃癌细胞株BGC823/shMARCH2发现，沉默MARCH2能够抑制胃癌细胞BGC823体外增殖、侵袭及体内肺转移能力，说明MARCH2表达与胃癌的增殖、侵袭及转移密切相关。

沉默MARCH2通过ATF4-CHOP-TRIB3-AKT-MTOR轴调控结肠癌细胞自噬^[18]，通过诱导内质网应急从而抑制结直肠癌生长^[19]。MARCH2通过促进CFTR泛素化和降解以及PIK3CA-AKT-MTOR信号传导调节自噬^[20]，说明MARCH2在一些肿瘤进展过程中与自噬密切相关。自噬是一个相对保守的过程，广泛存在于真核细胞并通过溶酶体或液泡被水解酶降解，在细胞增殖、分化和衰老中具有重要作用，细胞自噬基因突变会导致疾病及肿瘤发生^[21-22]。

本研究发现，自噬调节因子MARCH2在胃癌组织中高表达，并与患者预后有关，MARCH2促进胃癌细胞株BGC823的体外增殖、侵袭及体内肺转移能力，但MARCH2作用的相关机制及相关信号通路还有待进一步研究。MARCH2有望成为临床胃癌诊治及新药研究靶点依据。