2026, Vol. 41文章信息
- 罗孔亮, 丁敬健, 王涛, 王桁扬
- Luo Kongliang, Ding Jingjian, Wang Tao, Wang Hengyang
- 硬度激活的lncRNA PSMA3-AS1靶向miR-378a-3p/ZFP36L2促进肝癌细胞增殖
- Matrix stiffness-induced lncRNA PSMA3-AS1 promotes proliferation of liver cancer cells via targeting miR-378a-3p/ZFP36L2
- 实用肿瘤杂志, 2026, 41(2): 136-146
- Journal of Practical Oncology, 2026, 41(2): 136-146
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通信作者
- 王桁扬，Email：vip3520215159@163.com
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文章历史
- 收稿日期：2024-12-27
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2. 西安交通大学第一附属医院普通外科, 陕西 西安 710061
2. Department of General Surgery, the First Affi liated Hospital of Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, China
全球癌症统计数据提示，肝癌是全球第六大最常见癌症和第三大癌症死亡原因[1]。其在我国发病率和死亡率较高。手术、放化疗和靶向治疗是其主要的治疗手段。肝癌具有易复发、易转移和耐药等的特点，故整体预后很不理想，研究其新的分子治疗靶点，可为新药开发提供理论基础[2]。
细胞外基质（extracellular matrix, ECM）是由细胞分泌并在组织中围绕在其周围的一种复杂结构，为细胞提供机械支持并参与多种生命活动[3]。既往研究证实，ECM硬度的增加可促进肝癌的发生和发展[4-5]。高ECM硬度是肝癌基本特征之一，结节性肝硬化也被认为是肝癌发生的高危因素[6]。
长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是一类长度 > 200 nt的不编码蛋白质的结构复杂的转录本。越来越多的研究表明，其异常表达可能由细胞外高基质硬度调节，且与肝癌的发生关系密切，有潜力成为肿瘤治疗的靶点和肿瘤诊断与预后的分子标志物[7]。既往研究发现，lncRNA proteasome 20S subunit alpha 3（PSMA3）反义链1（PSMA3 antisense RNA 1，PSMA3-AS1）促进结直肠癌[8]、胃癌[9]、肺癌[10]、乳腺癌[11]、卵巢癌[12]和肝癌[13]等的发生和发展。但肿瘤基质硬度微环境对其调节情况并未被阐明。
microRNA（miRNA）是一种非编码的小分子RNA，长度约为19~23 nt，可在转录水平对蛋白质合成进行调控。miRNA通过与目标mRNA 3’端非翻译区（3'-untranslated region, 3'UTR）结合，阻止其翻译或促进其降解，从而调节该基因的表达[14]。Starbase预测结果显示，lncRNA PSMA3-AS1与miR-378a-3p存在可能的结合位点。miR-378a-3p在肾癌中高表达，促进肾癌的进展[15]。miR-378a-3p可成为化疗诱发的外泌体主要成分，促进乳腺癌的化疗耐药[16]。胃癌中的miR-378a-3p可靶向RAB31减弱胃癌干性[17]。肝癌中miR-378a-3p能抑制血管生成，延缓肿瘤发展[18]。但肝癌中lncRNA PSMA3-AS1与miR-378a-3p的潜在调控关系尚未被阐明。
锌指蛋白36环指样2（zinc finger protein 36 ring finger protein like 2, ZFP36L2）是一种锌指蛋白，属于锌指蛋白36（zinc finger protein 36, ZFP36）家族的一员，在多种生物学过程中发挥作用，包括基因表达调控和mRNA降解等[19-20]。通过多个数据库预测和筛选，确定miR-378a-3p与ZFP36L2 mRNA之间潜在的直接调控关系。研究表明，ZFP36L2促进胰腺癌[21]和子宫颈癌[22]等的进展。但肝癌中miR-378a-3p与ZFP36L2的潜在调控关系尚未被阐明。因此，本文拟进一步探讨lncRNA PSMA3-AS1与miR-378a-3p/ZFP36L2的靶向调控关系及其在肝癌细胞增殖中的作用。
1 资料与方法 1.1 患者及其样本采集30例肝癌及其癌旁组织取自2020年1月1日至2023年12月1日西安交通大学第一附属医院行肝癌切除术的患者。所有患者均符合美国肝病研究协会标准[23]诊断为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）。患者年龄46~72岁，中位年龄61岁；男性22例，女性8例。组织在液氮中快速冷冻并保存在-80℃。所有患者均签署知情同意书。本研究经西安交通大学第一附属医院伦理委员会审核批准（审批号：LLSBPJ-2024-32）。
1.2 细胞和试剂人肝母细胞瘤细胞系Hep-G2和人肝癌细胞系SK-Hep-1购自中科院上海细胞库，保存于西安交通大学第一附属医院肝胆外科实验室液氮中。细胞的保存和使用严格遵循《人类生物样本保藏伦理要求》[24]。DMEM培养液、胎牛血清、青霉素-链霉素混悬液和胰蛋白酶均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。Trizol试剂和LipofectamineTM 3000转染试剂购自美国Invitrogen公司。RT试剂盒和SYBR Green酶购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。双荧光素酶活性试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。双荧光素酶报告基因载体、lncRNA PSMA3-AS1小干扰RNA（si-lncRNA PSMA3-AS1）及其阴性对照（negative control, NC；si-NC1）和miR-378a-3p小干扰RNA（si-miR-378a-3p）及其NC（si-NC2）购自安诺伦（北京）生物科技有限公司。聚丙烯酰胺凝胶制备试剂盒购自西安市陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司。lncRNA PSMA3-AS1过表达载体（pcDNA3.1-lncRNA PSMA3-AS1）及其空载体（pcDNA3.1）、miR-378a-3p寡核苷酸模拟物（miR-378a-3p mimics）及其NC（control）和ZFP36L2小干扰RNA（si-ZFP36L2）及其NC（si-NC3）购自广州市锐博生物科技有限公司。ZFP36L2过表达载体（pCDH-ZFP36L2）及其空载（pCDH）购自北京擎科生物科技股份有限公司。ZFP36L2兔多克隆抗体（19005-1-AP）和辣根过化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记山羊抗兔IgG二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司。
1.3 方法 1.3.1 不同硬度聚丙烯酰胺凝胶制备按照既往研究所述[25]，将一定比例的丙烯酰胺、双丙烯酰胺、ddH2O、四甲基乙二胺（N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine, TEMED）、过硫酸铵（ammonium persulfate, APS）和十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）混合。将混合物移至0.4% 3-甲基丙氧丙基三甲氧基硅烷（3-methacryloxypropyltrimethoxysilane, MPS）处理过的玻片，顶部用另一玻片覆盖，提前用水溶性硅化液SurfafSil疏水处理。取下上盖用HEPES缓冲液处理凝胶20 min，再用Ⅰ型胶原蛋白溶液孵育30 min后，PBS冲洗微波加热杀菌备用。
1.3.2 细胞培养Hep-G2和SK-Hep-1细胞均使用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养液，在5%CO2、37℃条件下培养。
1.3.3 细胞转染取对数生长期细胞，提前1 d均匀铺在培养板中，细胞融合度为50%~60%时，更换新鲜的完全培养液备用。将对应量的DNA或RNA用无血清DMEM稀释，加入P3000试剂记为管1。lipofectamineTM 3000用无血清DMEM稀释记为管2。管1和管2内容物各自混匀后，将管1溶液加入管2中混匀，室温静置15 min后，将全部混合物加入备用细胞中，培养48~72 h后检测。
1.3.4 RNA提取使用Trizol法提取组织和细胞总RNA。组织经液氮冷冻研磨，细胞直接加入Trizol裂解。经过氯仿抽提，异丙醇沉淀和乙醇洗涤，最后用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate, DEPC）水溶解。用微量分光光度计定量后保存于-80℃。
1.3.5 qRT-PCR分析使用RNA逆转录试剂盒逆转录合成cDNA。PCR扩增体系：10 μL SYBR Green、正反向引物各1 μL和cDNA 3 μL，再加ddH2O补至20 μL。循环条件：预变性95℃ 3 min，95℃变性5 s，60℃退火延伸34 s，循环数40次。相对标准法（2-ΔΔCt）计算相对表达量。
1.3.6 双荧光素酶报告基因首先构建包含结合位点与突变位点的荧光素酶报告载体，包括lncRNA PSMA3-AS1-野生型（wild type, WT）、lncRNA PSMA3-AS1-突变型（mutant, MUT）、ZFP36L2-WT和ZFP36L2-MUT。将细胞种在24孔板中，将上述载体与miR-378a-3p和miR-NC共转染至细胞中，48 h后检测荧光强度。
1.3.7 Westernblot使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法定量蛋白浓度，将每个样品30 μg蛋白加入凝胶中电泳分离。使用PVDF膜转印后脱脂牛奶封闭2 h，一抗在4℃下孵育过夜，第2天TBST洗涤后加入二抗室温孵育1 h，再次TBST洗涤后使用显影液显影。
1.3.8 细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8, CCK-8）细胞增殖实验细胞转染或相应干预后消化计数，每孔2×104个细胞种入96孔板，后加入CCK-8试剂孵育1 h，酶标仪测量450 nm处的吸光度（absorbance at 450 nm, A450）值，分别测量细胞在96孔板中培养0、24、48和72 h后的A450值。
1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件分析数据。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用配对t检验。两独立组间比较采用双尾t检验。相关性分析采用Pearson相关性检验。所有实验独立重复3次。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 基质硬度激活的lncRNA PSMA3-AS1促进肝癌细胞增殖qRT-PCR法检测肝癌组织及其癌旁组织中lncRNA PSMA3-AS1的表达量显示，与低硬度的癌旁组织比较，高硬度的肝癌组织中lncRNA PSMA3-AS1表达量升高（P < 0.01，图 1A）。将Hep-G2和SK-Hep-1细胞分别接种在高硬度（25.6 kPa）和低硬度（0.4 kPa）的聚丙烯酰胺凝胶上，模拟不同ECM硬度对细胞的影响。qRT-PCR结果表明，2种细胞的lncRNA PSMA3-AS1表达量在高硬度凝胶上均高于低硬度凝胶（均P < 0.01，图 1B~1C）。
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| 注 A：qRT-PCR检测肝癌组织及其癌旁组织中lncRNA PSMA3-AS1的表达量；B：qRT-PCR检测种植在低硬度（0.4 kPa）和高硬度（25.6 kPa）聚丙烯酰胺凝胶上培养24 h后的Hep-G2细胞中lncRNA PSMA3-AS1的表达量；C：qRT-PCR检测种植在低硬度（0.4 kPa）和高硬度（25.6 kPa）聚丙烯酰胺凝胶上培养24 h后的SK-Hep-1细胞中lncRNA PSMA3-AS1的表达量；D：qRT-PC验证Hep-G2细胞中过表达lncRNA PSMA3-AS1的效果；E：CCK-8法检测过表达lncRNA PSMA3-AS1的Hep-G2细胞的增殖能力；F：qRT-PCR验证SK-Hep-1细胞中干扰lncRNA PSMA3-AS1的表达效果；G：CCK-8法检测干扰lncRNA PSMA3-AS1表达的SK-Hep-1细胞的增殖能力；lncRNA：长链非编码RNA（long non-coding RNA）；PSMA3：proteasome 20S subunit alpha 3；AS：反义链（antisense RNA）；NC：阴性对照（negative control）；*P < 0.05；**P < 0.01 图 1 基质硬度激活的lncRNA PSMA3-AS1促进肝癌细胞Hep-G2和SK-Hep-1的增殖 Fig.1 LncRNA PSMA3-AS1 activated by matrix stiffness promoted the proliferation of liver cancer Hep-G2 and SK-Hep-1 cells |
CCK8细胞增殖实验表明，过表达lncRNA PSMA3-AS1提高Hep-G2细胞的增殖能力（P < 0.05，图 1D~1E），干扰lncRNA PSMA3-AS1降低SK-Hep-1细胞的增殖能力（P < 0.05，图 1F~1G）。
2.2 肝癌中lncRNA PSMA3-AS1靶向调控miR-378a-3pStarbase预测miR-378a-3p与lncRNA PSMA3-AS1存在结合位点，故可能为直接调控关系（图 2A）。双荧光素酶报告实验证实，miR-378a-3p可与lncRNA PSMA3-AS1结合，存在调控关系（P < 0.01，图 2B）。SK-Hep-1细胞中干扰lncRNA PSMA3-AS1表达，miR-378a-3p表达升高（P < 0.01，图 2C）。Hep-G2细胞中过表达lncRNA PSMA3-AS1，miR-378a-3p表达下降（P < 0.01，图 2D）。Starbase数据库分析显示，lncRNA PSMA3-AS1与miR-378a-3p在370例肝癌组织中的表达呈负相关（r=-0.190，P < 0.01；图 2E）。本院组织样本中同样证实该结果（r=-0.525 1，P < 0.01；图 2F）。以上结果表明，lncRNA PSMA3-AS1与miR-378a-3p可直接结合，lncRNA PSMA3-AS1直接负向调控miR-378a-3p的表达。
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| 注 A：Starbase数据库预测lncRNA PSMA3-AS1与miR-378a-3p结合位点；B：双荧光素酶活性检测示lncRNA PSMA3-AS1与miR-378a-3p结合；C：qRT-PCR法检测SK-Hep-1细胞中干扰lncRNA PSMA3-AS1表达后24 h miR-378a-3p的表达水平；D：qRT-PCR法检测Hep-G2细胞中过表达lncRNA PSMA3-AS1后24 h miR-378a-3p的表达水平；E：Starbase数据库370例LIHC组织中lncRNA PSMA3-AS1与miR-378a-3p表达量的相关性分析；F：30例肝癌组织中lncRNA PSMA3-AS1与miR-378a-3p表达量的相关性分析；lncRNA：长链非编码RNA（long non-coding RNA）；PSMA3：proteasome 20S subunit alpha 3；AS：反义链（antisense RNA）；NC：阴性对照（negative control）；WT：野生型（wild type）；MUT：突变型（mutant）；FPKM：fragments per kilobase of transcript per million mapped fragments；RPM：reads per million mapped reads；**P < 0.01 图 2 肝癌中lncRNA PSMA3-AS1靶向调控miR-378a-3p Fig.2 LncRNA PSMA3-AS1 targeted miR-378a-3p in liver cancer |
Starbase数据库数据显示，miR-378a-3p在肝癌组织中表达量降低（P < 0.01，图 3A）。qRT-PCR检测肝癌及其癌旁组织中miR-378a-3p的表达显示，与低硬度的癌旁组织比较，高硬度肝癌组织中miR-378a-3p表达降低（P < 0.01，图 3B）。将Hep-G2细胞分别接种在高硬度（25.6 kPa）和低硬度（0.4 kPa）的聚丙烯酰胺凝胶上，模拟不同ECM硬度环境。qRT-PCR结果表明，高硬度凝胶可下调miR-378a-3p的表达量（P < 0.01，图 3C）。在SK-Hep-1细胞中结果相同（P < 0.01，图 3D）。CCK8检测显示，过表达miR-378a-3p抑制SK-Hep-1细胞的增殖（P < 0.01，图 3E~3F），而干扰miR-378a-3p表达促进HEP-G2细胞的增殖（P < 0.01，图 3G~3H）。上述结果表明，lncRNA PSMA3-AS1的直接下游miR-378a-3p在硬度环境下被间接下调，miR-378a-3p在肝癌中起抑制细胞增殖的作用。
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| 注 A：Starbase数据库中miR-378a-3p在肝细胞癌组织与癌旁正常肝组织中的表达量；B：qRT-PCR法检测肝癌组织及其癌旁组织中miR-378a-3p的表达量；C：qRT-PCR检测种植在低硬度（0.4 kPa）和高硬度（25.6 kPa）聚丙烯酰胺凝胶上的Hep-G2细胞中miR-378a-3p的表达量；D：qRT-PCR检测种植在低硬度（0.4 kPa）和高硬度（25.6 kPa）聚丙烯酰胺凝胶上的SK-Hep-1细胞中miR-378a-3p的表达量；E：qRT-PC验证SK-Hep-1细胞中过表达miR-378a-3p的效果；F：CCK-8法检测过表达miR-378a-3p的SK-Hep-1细胞的增殖能力；G：qRT-PC验证Hep-G2细胞中干扰miR-378a-3p表达的效果；H：CCK-8法检测干扰miR-378a-3p表达的Hep-G2细胞的增殖能力；LIHC：肝细胞癌（liver hepatocellular carcinoma）；RPM：reads per million mapped reads；NC：阴性对照（negative control）；**P < 0.01 图 3 基质硬度下调的miR-378a-3p抑制肝癌细胞的增殖 Fig.3 miR-378a-3p down-regulated by matrix stiffness inhibited the proliferation of liver cancer cells |
为探究miR-378a-3p下游的潜在靶基因，在3个公共数据库（miRanda、miRmap和TargetScan）中筛选出10个与miR-378a-3p有可能结合位点的基因（图 4A），分别为无CAAX结构域的类似ras蛋白1（ras like without CAAX 1, RIT1）、ZFP36L2、含SFT2结构域3（SFT2 domain containing 3, SFT2D3）、Nance-Horan综合征蛋白类似3（Nance-Horan syndrome protein like 3, NHSL3；也称KIAA1522）、肽酰精氨酸脱亚氨酶4（peptidyl arginine deiminase 4, PDIA4）、RNA结合基序单链相互作用蛋白1（RNA binding motif single stranded interacting protein 1, RBMS1）、骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2, BMP2）、白细胞介素6细胞因子家族信号转导器（interleukin 6 cytokine family signal transducer, IL6ST）、FK506结合蛋白精氨酸异构酶5（FK506 binding protein prolyl isomerase 5, FKBP5）和阿戈诺特RNA诱导的沉默复合体组件1（argonaute RNA-induced silencing complex component 1, AGO1）。Hep-G2细胞中干扰miR-378a-3p的表达，筛选上述10个潜在靶点，发现只有ZFP36L2的mRNA表达量升高（P < 0.05，图 4B）。SK-Hep-1细胞中过表达miR-378a-3p，发现只有ZFP36L2的mRNA表达量降低（P < 0.05，图 4C）。在多个数据库（miRmap、TargetScan、PITA、miRanda和microT）中确认基因ZFP36L2与miR-378a-3p存在结合位点（图 4D）。通过数据库筛选，ZFP36L2可能是miR-378a-3p的下游靶点。
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| 注 A：miRanda、miRmap和TargetScan数据库中筛选miR-378a-3p下游潜在10个靶点；B：qRT-PCR检测Hep-G2细胞中干扰miR-378a-3p表达24 h后10个潜在靶点的mRNA表达水平；C：qRT-PCR检测SK-Hep-1细胞中过表达miR-378a-3p 24 h后10个潜在靶点的mRNA表达水平；D：miRmap、TargetScan、PITA、miRanda和microT数据库分析miR-378a-3p与ZFP36L2的结合位点；RIT1：无CAAX结构域的类似ras蛋白1（ras like without CAAX 1）；ZFP36L2：锌指蛋白36环指样2（zinc finger protein 36 ring finger protein like 2）；SFT2D3：含SFT2结构域3（SFT2 domain containing 3）；KIAA1522：Nance-Horan综合征蛋白类似3（Nance-Horan syndrome protein like 3）；PDIA4：肽酰精氨酸脱亚氨酶4（peptidyl arginine deiminase 4）；RBMS1：RNA结合基序单链相互作用蛋白1（RNA binding motif single stranded interacting protein 1）；BMP2：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2）；IL6ST：白细胞介素6细胞因子家族信号转导器（interleukin 6 cytokine family signal transducer）；FKBP5：FK506结合蛋白精氨酸异构酶5（FK506 binding protein prolyl isomerase 5）；AGO1：阿戈诺特RNA诱导的沉默复合体组件1（argonaute RNA-induced silencing complex component 1）；NC：阴性对照（negative control）；*P < 0.05 图 4 肝癌细胞中miR-378a-3p下游靶点筛选 Fig.4 Downstream target screening of miR-378a-3p in liver cancer cells |
双荧光素酶报告实验证实，ZFP36L2与miR-378a-3p可直接结合（P < 0.01，图 5A）。SK-Hep-1细胞中过表达miR-378a-3p可下调ZFP36L2蛋白水平（P < 0.01，图 5B）。Hep-G2细胞中干扰miR-378a-3p可上调ZFP36L2蛋白水平（P < 0.01，图 5C）。Starbase数据库中，miR-378a-3p与ZFP36L2的表达水平在370例肝癌标本中的表达呈负相关（r=-0.270，P < 0.01；图 5D）。本院标本也得出相同结果（r=-0.451 5，P < 0.05；图 5E）。由此确认，肝癌中ZFP36L2为miR-378a-3p的下游，miR-378a-3p可靶向负向调控ZFP36L2的表达。
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| 注 A：双荧光素酶活性检测示miR-378a-3p对ZFP36L2的调控作用；B：Western blot检测SK-Hep-1细胞中过表达miR-378a-3p 24 h后ZFP36L2的蛋白表达量；C：Western blot检测Hep-G2细胞中干扰miR-378a-3p表达24 h后ZFP36L2的蛋白表达量；D：Starbase数据库中370例肝细胞癌组织中ZFP36L2与miR-378a-3p表达量的相关性分析；E：30例肝癌组织中ZFP36L2与miR-378a-3p表达量的相关性分析；NC：阴性对照（negative control）；ZFP36L2：锌指蛋白36环指样2（zinc finger protein 36 ring finger protein like 2）；WT：野生型（wild type）；MUT：突变型（mutant）；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)；FPKM：fragments per kilobase of transcript per million mapped fragments；RPM：reads per million mapped reads；**P < 0.01 图 5 肝癌中miR-378a-3p靶向调控ZFP36L2 Fig.5 miR-378a-3p targeted ZFP36L2 in liver cancer |
Starbase数据库中ZFP36L2在肝癌中的表达略有升高，但差异无统计学意义（P=0.08，图 6A）。本院标本qRT-PCR检测显示，肝癌中ZFP36L2表达高于癌旁组织（P < 0.01，图 6B）。CCK8实验证实，干扰ZFP36L2的表达抑制SK-Hep-1细胞的增殖（P < 0.05，图 6C~6D）。Hep-G2细胞中过表达ZFP36L2（P < 0.01，图 6E），可促进细胞增殖（P < 0.01，图 6F）。
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| 注 A：Starbase数据库中在肝细胞癌组织与癌旁正常肝组织中ZFP36L2的表达量；B：qRT-PCR法检测肝癌及其癌旁组织中ZFP36L2 mRNA的表达量；C：Western blot检测SK-Hep-1细胞中干扰ZFP36L2表达的效果；D：CCK-8法检测干扰ZFP36L2表达的SK-Hep-1细胞的增殖能力；E：Western blot检测Hep-G2细胞中过表达ZFP36L2的效果；F：CCK-8法检测过表达ZFP36L2的Hep-G2细胞的增殖能力；LIHC：肝细胞癌（liver hepatocellular carcinoma）；ZFP36L2：锌指蛋白36环指样2（zinc finger protein 36 ring finger protein like 2）；FPKM：fragments per kilobase of transcript per million mapped fragments；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)；NC：阴性对照（negative control）；*P < 0.05；**P < 0.01 图 6 肝癌中高表达的ZFP36L2促进肝癌细胞的增殖 Fig.6 High expression of ZFP36L2 in liver cancer promoted the proliferation of liver cancer cells |
基质硬度对肿瘤的发生和发展有重要影响[26-28]。近年研究发现，基质硬度可以影响lncRNA的表达，从而参与生命活动过程[29-31]。LINC00458被发现是一个硬度依赖性lncRNA，在内胚层形成过程起关键作用[32]。nuclear paraspeckle assembly transcript 1（NEAT1）在肝癌中被鉴定为一个硬度响应的lncRNA，调节肝癌的恶性行为[33]。lncRNA PSMA3-AS1可通过阻断miR-186-5p介导的蛋白酶体激活子亚基3（proteasome activator subunit 3, PSME3）抑制来激活乳腺癌细胞的进展[11]。lncRNA PSMA3-AS1在肝癌中高表达，靶向miR-627-3p，促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭[13]。但影响lncRNA PSMA3-AS1表达的微环境机制尚未被阐明。本研究鉴定lncRNA PSMA3-AS1为硬度反应性lncRNA，可被高基质硬度上调，在硬度较高的肝癌组织中被上调，发挥相应功能，促进肝癌的恶性表型。此外，既往多项研究证实，Yes1联合转录调节因子（Yes1 associated transcriptional regulator, YAP）/tafazzin（TAZ）通路作为潜在硬度信号传递桥梁[34]，硬基质通过integrin-黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）信号维持YAP活化[35]，而ZFP36L2可能通过调控Hippo通路相关因子打破这种力学稳态。
lncRNA通常被认为是miRNA的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA, ceRNA），通过调节下游的miRNA发挥多种生物功能，尤其是肿瘤的发生和发展[36]。本研究发现，肝癌中miR-378a-3p是lncRNA PSMA3-AS1的下游靶点。miR-378a-3p在不同肿瘤中发挥不同功能。其在肾癌中表达量升高，促进肾癌进展[15]；在乳腺癌中促进化疗耐药，起促癌作用[16]；在胃癌中可减弱胃癌干性[17]；在肝癌中抑制血管生成[18]，起抑癌作用。但lncRNA PSMA3-AS1与miR-378a-3p在肝癌中的调控关系未被阐明。本文阐明lncRNA PSMA3-AS1与miR-378a-3p的直接调控关系。lncRNA PSMA3-AS1通过调控miR-378a-3p的表达，调节肝癌细胞的增殖。miR-378a-3p在肝癌中抑制细胞增殖，起抑癌作用。由于lncRNA通常被认为是miRNA的ceRNA，当lncRNA PSMA3-AS1表达量超过临界值时，其作为miRNA海绵的效应才会显现。这解释了为何干扰lncRNA PSMA3-AS1会导致miR-378a-3p释放并激活ZFP36L2。
ZFP36L2作为一种研究较少的锌指蛋白，参与的生物学过程集中在基因表达调控和mRNA降解等[19-20]。其在胰腺癌[21]和子宫颈癌[22]中被确认为癌基因，促进肿瘤进展。ZFP36L2属于tristetraprolin（TTP）家族RNA结合蛋白，主要通过结合靶mRNA的AU富集元件（AU-rich element, ARE），促进其降解或抑制翻译，从而在转录后水平调控基因表达。其靶基因可能涉及ECM相关分子，如胶原蛋白1A1（collagen 1A1, COL1A1）和COL3A1、纤连蛋白1（fibronectin 1, FN1）或基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）[37]。但其在肝癌中的作用尚不清楚。本研究通过数据库筛选和实验验证确认ZFP36L2为miR-378a-3p的下游靶点。miR-378a-3p通过下调ZFP36L2表达，抑制肝癌细胞的增殖，从而起到抑制癌症进展的作用。ZFP36L2促进肝癌细胞的增殖。
综上所述，基质硬度在肝癌中上调lncRNA PSMA3-AS1表达。干扰lncRNA PSMA3-AS1表达可上调其下游miR-378a-3p的表达，从而抑制其下游ZFP36L2表达，抑制肝癌细胞增殖。故lncRNA PSMA3-AS1、miR-378a-3p和ZFP36L2可作为肝癌分子治疗的潜在新靶点，成为后续药物开发的基础。ZFP36L2的其他调控机制和其他生物学功能还有待进一步的研究。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
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