弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤，占我国非霍奇金淋巴瘤的50%。DLBCL肿瘤细胞广泛表达白细胞分化抗原20（cluster of differentiation 20，CD20），CD20阴性的DLBCL非常罕见，仅占所有DLBCL的1%~2%^[1]。最常见的CD20阴性的DLBCL包括浆母细胞淋巴瘤（plasmablastic lymphoma，PBL）、原发性渗出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）、起源于人类疱疹病毒8（human herpes virus-8，HHV8）型多中心Castleman病的大B细胞淋巴瘤以及间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）阳性的大B细胞淋巴瘤等特殊类型。另外，亦有报道，惰性B细胞淋巴瘤向DLBCL转化，应用利妥昔单抗治疗后可出现CD20抗原表达的丢失^[2]。本文报道3例结外原发性非特殊型CD20阴性DLBCL，并结合文献分析其临床病理特征，以提高对此类罕见淋巴瘤的认识。

1 资料与方法 1.1 一般资料

收集2012年11月至2020年5月陕西省人民医院收治并病理活检诊断为DLBCL的标本共192例，从中筛选出3例诊断明确的结外原发的CD20阴性DLBCL病例，复习其临床资料和病理切片。本研究已通过陕西省人民医院医学伦理委员会审批。

1.2 方法

标本均经4%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm切片，HE染色。采用EliVision免疫组织化学方法检测CD3、CD20、CD21、CD79a、B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-6、c-myc、CD10、配对盒基因5（paired box domain 5，PAX5）、多发性骨髓瘤癌基因蛋白-1（multiple myeloma oncogene 1，MUM1）、CD5、CyclinD1、CD38、CD138、ALK、CD30和Ki-67等免疫组织化学标志物。所有试剂均购于福州迈新生物技术公司，实验严格按照标准程序操作，染色过程设阳性及阴性对照。依据不同抗体的显色部位，肿瘤细胞胞质、胞膜或胞核出现棕黄色颗粒或染色即为阳性。

1.3 Epstein-Barr（EB）病毒编码的小RNA（EB virus encoded small RNA，EBER）原位杂交

应用原位杂交方法检测EB病毒在3例DLBCL中的表达。病毒原位杂交采用地戈辛标记的EBER1/2 DNA探针，检测组织中EB病毒编码的小RNA。试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，实验操作严格按说明书进行。采用已知的阳性病例作为阳性对照，以杂交液中不加寡核苷酸探针为阴性对照。EBER原位杂交以细胞核染色棕黄和出现棕褐色颗粒记为阳性信号。

2 结果 2.1 临床资料

病例1，女性，69岁，2016年3月1日以发现右乳肿物24 d收治陕西省人民医院，右乳外侧距乳头2.0 cm处可触及一枚质韧肿物，大小约3.0 cm×2.0 cm，界欠清，活动度欠佳，有压痛。右侧腋下可触及一大小约1.0 cm×1.0 cm淋巴结。乳腺钼靶示：右乳外侧象限肿块，右乳晕后可疑结节，右侧腋窝淋巴结略大；乳腺B型超声：右乳低回声包块，乳腺影像报告和数据系统（Breast Imaging Reporting and Data System，BI-RADS）4级。考虑乳腺癌可能性大。2016年3月7日行右乳腺全切除+右侧前哨淋巴结活检+右腋窝淋巴结清扫术。

病例2，男性，78岁，2013年4月24日以反复腹痛2年余及加重6 h收治陕西省人民医院。2年前患者无明显诱因出现腹痛，以右上腹为主，后诊断为慢性结石性胆囊炎和胆总管结石，在外院行胆囊切除术及胆管探查术，术后病情平稳。1年来反复出现腹胀和腹痛，伴有恶心及呕吐，在外院行胃镜及肠镜检查未见明显异常，后行CT检查示胆总管结石，遂行胰胆管造影及十二指肠乳头切开取石术，术后症状缓解，2013年4月30日再次出现上述症状，立位腹平片示急性不全性小肠梗阻。腹部CT平扫示：空肠近端局限性肠壁明显增厚，肠腔变窄，考虑为占位性病变。十二指肠镜检查示：十二指肠隆起性质待定。2013年5月2日行病理活检。

病例3，女性，51岁，2015年3月27日以间断便血3个月余再发5 d收治陕西省人民医院。3个月前进食刺激性食物后出现小腹部不适和便血症状，为暗红色血液，每次量约700 mL，每天便血1~2次。当地医院行胃镜检查示胃窦小息肉，肠镜检查示溃疡性结肠炎。治疗后仍有间断便血，遂来本院就诊，入院时血红蛋白（hemoglobin，HGB）为83 g/L。上、下腹部CT平扫示：右半结肠软组织肿块，考虑肿瘤性病变。纠正贫血后行肠镜检查示：回肠末端隆起性病变。2015年4月1日行病理活检。

以上患者确诊后，病例2因年事已高，且有基础病变，拒绝进一步治疗，于确诊6个月后死亡。病例1和3确诊后均行CHOP方案（环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松）化疗，效果不佳，分别于确诊后13个月和19个月死亡。

2.2 病理检查

镜下见组织结构破坏，大量异型淋巴样细胞弥漫性浸润（图 1A），淋巴样细胞体积大，胞质丰富，核卵圆形或不规则形，核膜厚，染色质粗，核仁明显，形似免疫母细胞或中心母细胞，核分裂象易见（图 1B），部分病例背景可见散在中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及小淋巴细胞。免疫表型：3例经重复实验，均不表达CD20，CD79a和PAX-5阳性，CD3和CD5等T细胞标记均为阴性，CD38、CD138、ALK、CD30、CyclinD1和末端转移酶（terminal transferase，TdT）均阴性表达，3例CD10均为阴性表达，MUM1均阳性表达，2例Bcl-6阳性表达，Ki-67指数40%~80%（图 2）。3例标本中EB病毒检测均为阴性。病理诊断为CD20阴性DLBCL，非生发中心B细胞样（non-germinal center B-cell like，non-GCB）型（表 1）。

3 讨论

DLBCL是成人非霍奇金淋巴瘤最常见的类型，在西方国家约占成年非霍奇金淋巴瘤患者的25%~30%，在我国约占非霍奇金淋巴瘤的50%^{[1, 3]}。DLBCL是一组具有异质性的肿瘤，在形态学、免疫表型、基因改变、临床特征、对治疗的反应以及预后等方面存在差异。CD20为一种定位于B细胞表面并涉及B细胞分化的跨膜蛋白。作为广谱B细胞标志物，CD20广泛表达于从前B细胞（pre-B cell）至成熟B细胞多个发育阶段，但在造血干细胞和浆细胞中并不表达，是调节B细胞增殖和分化信号途径的一部分。CD20蛋白表达于＞90%的B细胞淋巴瘤，约98%的DLBCL表达CD20，仅1%~2%的DLBCL不表达CD20。最常见的CD20阴性DLBCL包括PBL、PEL、HHV8型多中心Castleman病的大B细胞淋巴瘤以及ALK阳性的大B细胞淋巴瘤等特殊变异亚型。这类淋巴瘤往往更具侵袭性，患者常存在免疫抑制，合并病毒感染。另有一些非常罕见的CD20阴性DLBCL病例被报道，这些病例不符合以上常见DLBCL亚型的临床、组织学形态、免疫组织化学或遗传学标准，在CD20阴性DLBCL的已知亚型中是不可分类的。

利妥昔单抗是一种人鼠嵌合型CD20单克隆抗体，目前已经广泛应用于临床。其联合CHOP化疗方案的R-CHOP方案已经成为CD20阳性的非霍奇金B细胞淋巴瘤的一线治疗措施。利妥昔单抗主要通过特异性结合B细胞表面CD20抗原，引导患者免疫系统，通过抗体依赖的细胞毒作用（antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（complement-dependent cytotoxicity，CDC）、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制B细胞增殖、诱导B细胞凋亡和增加淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性等发挥其抗肿瘤作用^[4]。经利妥昔单抗治疗后，B细胞淋巴瘤发生CD20抗原丢失的现象屡见报道。Hiraga等^[5]对124例使用利妥昔单抗治疗的B细胞淋巴瘤患者进行随访观察，共有36例出现CD20抗体表达丢失，发生率为29%。其中以慢性淋巴细胞性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤最为多见^[6]。另有一部分惰性B细胞淋巴瘤经利妥昔单抗治疗后，可以向更高级别的淋巴瘤转化，并且伴有CD20抗原表达的丢失，这种现象多发生于滤泡性淋巴瘤向DLBCL转化。也有一些DLBCL经利妥昔单抗治疗后可发生CD20抗原的丢失^[7]。

本组3例初诊，经多次重复B细胞标志物检查，CD20阴性，而CD79a和PAX5等B细胞标志物阳性，CD38、CD138及ALK均为阴性，EBER原位杂交均为阴性，不同于以往报道的特殊亚型的CD20阴性DLBCL，均为结外新发CD20阴性DLBCL（非特指型）。CD20阴性DLBCL（非特指型）相当罕见，国内外仅有少量报道，且多为个案汇报。CD20阴性DLBCL似乎更易出现结外受累。有研究报道，37例新发DLBCL中8例CD20阴性，其中2例存在结外受累^[8]。另有学者报道，28例CD20阴性DLBCL患者中，21例存在结外受累^[9]。然而，原发结外的CD20阴性DLBCL相当罕见。Garrido-Abad等^[10]报道1例原发睾丸的CD20阴性DLBCL病例。Shukla等^[11]报道1例原发于乳腺的CD20阴性DLBCL病例。我国学者亦报道1例原发肠道的CD20阴性DLBCL1例^[12]。本组3例CD20阴性DLBCL病例分别发生于乳腺、十二指肠及回肠末端，以结外病变为主要临床表现，伴或不伴区域淋巴结受累，符合结外原发CD20阴性DLBCL诊断。

CD20阴性DLBCL Hans分型以non-GCB型多见。国外报道2例及国内报道1例淋巴结CD20阴性DLBCL均为non-GCB型^{[7, 10-11]}。中山大学肿瘤中心研究l456例新发DLBCL患者，其中28例（1.9%）CD20阴性，这其中77.3%为non-GCB型^[9]。本研究中3例CD20阴性的DLBCL Hans分型均为non-GCB型，与以往报道相符^[9]。在基因表达谱研究结果的基础上，可依据CD10、BCL-6和MUM-1免疫表型将DLBCL分为生发中心B细胞样（germinal center B-cell like，GCB）型和non-GCB分子亚型^[13]。2种类型具有不同的预后，GCB型5年生存率为60%，而non-GCB型5年生存率仅为35%，non-GCB型及高Ki-67增殖指数在DLBCL中提示预后不良^[13]。CD20阴性DLBCL往往预后不良，而本组3例DLBCL全为non-GCB型，预后也较差。

检测CD20的表达状态对于临床评价利妥昔单抗的疗效以及患者的预后具有重要意义。目前对于CD20的检测主要有蛋白质水平的检测和RNA水平的检测。临床上普遍应用免疫组织化学法和流式细胞免疫表型分析检测CD20蛋白，多数情况下，两者检测结果相当，少数情况下存在差异。一般来说，流式细胞术较免疫组织化学法更为敏感，免疫组织化学检测只能达到对CD20的半定量检测，而流式细胞术可以达到对CD20的精确定量。近年来有研究表明，部分免疫组织化学法CD20阳性的DLBCL患者经流式细胞术检测为阴性^[8]。对于跨膜蛋白CD20，免疫组织化学以检测胞质内CD20蛋白为主，流式细胞术通常检测胞膜表面的CD20蛋白表位，二者可表达不一致，多数表现为胞膜表面表达缺失而胞质内部表达存在。对于RNA水平的检测主要是应用RT-PCR的方法对编码CD20的mRNA作检测，但由于存在有转录的RNA不一定有CD20蛋白的表达这样的问题，而且CD20蛋白合成后也可以出现转运至细胞膜表面的途径异常等，所以间接检测mRNA不一定能完全反映CD20在细胞膜上的表达。

B细胞淋巴瘤CD20抗原丢失的机制尚不明确，推测原因可能有以下3个方面：（1）CD20遗传物质水平的变化导致CD20抗原丢失（有研究发现，位于染色体11q12的CD20基因纯合性缺失，导致1例DLBCL患者瘤细胞CD20阴性^[14]；利妥昔单抗耐药细胞株的细胞膜表面CD20抗原和CD20 mRNA减少，出现CD20基因C-末端截短变异体或出现CD20基因C-末端缺失^[15]；CD20的编码基因M4SAl基因突变和基因转录水平的异常可导致CD20基因转录减少或CD20蛋白表达异常^[16]）；（2）CD20在蛋白水平的变化原因可能与细胞表面CD20抗原在细胞溶酶体的“内化”^[5]、CD20在蛋白酶体中降解的增加、CD20蛋白质折叠和结构异常导致功能学的异常以及CD20合成后转移至细胞膜表面的转运异常等有关^[16]；（3）肿瘤细胞的逃逸机制[有学者推测，原发肿瘤中已存在CD20阴性的肿瘤细胞，经利妥昔单抗药物的选择作用，使原来淋巴瘤中对利妥昔单抗不敏感的CD20阴性肿瘤细胞未被有效杀灭，从而导致选择性增殖使得肿瘤复发^[17]；检测初治时CD20阳性及复发时CD20阴性肿瘤细胞的免疫球蛋白重链可变区（immunoglobulin heavy chain variable region，IgvH）互补决定区同源，推测利妥昔单抗治疗前后CD20阳性和CD20阴性B细胞为相同的克隆起源，考虑可能肿瘤细胞中CD20抗体结合点大部分或全部被封闭，使药物作用不到肿瘤细胞^[18]，亦或者是由于利妥昔单抗药物作用引起肿瘤局部微环境变化从而导致肿瘤细胞进化成CD20阴性]。

CD20阴性DLBCL非常罕见，是一类侵袭性较强且较难诊断的淋巴组织增殖性疾病。CD20阴性患者不能从利妥昔单抗应用中获益，预后不佳，生存时间短。CD20阴性DLBCL的病例较少，缺乏标准的治疗方案，对于传统的CHOP和R-CHOP方案治疗反应差，根据NCCN DLBCL治疗指南，可尝试联合放疗及含苯达莫司汀和来那度胺等药物的二线治疗方案^[19]，但由于CD20阴性DLBCL患者较为少见，治疗方案及疗效反应还需进一步探索。此类淋巴瘤往往发生于存在免疫抑制合并病毒感染、被诊断为特殊亚型亦或是利妥昔单抗治疗后的患者，而原发非特殊型CD20阴性DLBCL尤为罕见，也给诊断带来一定挑战，CD20阴性并不能排除DLBCL的诊断，此时需结合其他B细胞标志物，方能作出正确的诊断。