乳腺癌已经成为全球最常见的癌症，我国发病率增速更快，年轻化趋势更为显著^[1]。近年来，乳腺癌的整体生存率虽然得到提高，但三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）及进展期乳腺癌由于缺乏针对性的治疗手段，死亡率更高，预后更差^[2]。在过去的10~15年中，随着对乳腺癌异质性认识的不断深入，出现了许多分子水平的靶向治疗手段，丰富了乳腺癌的治疗方式^[3]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]抑制剂（PARP inhibitor，PARPi）是一种新型的靶向治疗药物，近年来逐渐被用于包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤的治疗，并取得许多令人瞩目的成绩，成为当下肿瘤研究的热点之一。然而PARPi的耐药问题限制其在恶性肿瘤中的进一步应用。

1 PARPi的作用机制及其在乳腺癌中的应用

PARPi主要有苯甲酰胺衍生物及环酰胺衍生物两大类，已被美国食品和药物管理局批准应用于乳腺癌易感基因1/2（breast cancer susceptibility gene 1/2，BRCA1/2）突变的乳腺癌、卵巢癌以及部分前列腺癌；胰腺癌的二和三期临床试验仍在进行中。我国于2018年批准首个PARPi奥拉帕利（olaparib）应用于卵巢癌，在2020年12月首个自研的PARPi氟唑帕利（fluzoparib）也获批上市。目前常见的PARPi包括奥拉帕利、维拉帕利（veliparib）、鲁卡帕利（rucaparib）、伊尼帕利（iniparib）、尼拉帕利（niraparib）和他拉唑帕利（talazoparib）。不同的PARPi抑制PARP催化活性的能力相似，但对PARP的捕获能力存在较大差异。PARPi捕获DNA的能力大小为talazoparib > niraparib > olaparib=rucaparib > veliparib。

PARPi主要通过抑制PARP酶的活性以及将PARP捕获到DNA损伤处引起DNA单链损伤无法正常修复^[4]。目前认为PARP的捕获在治疗中起到更为主要的作用。一方面，PAPPi与PARP催化区中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）+竞争性结合从而抑制PARP酶的活性，导致下游的DNA修复蛋白无法被募集到DNA损伤处；另一方面，PARPi通过抑制结合在DNA损伤位点的PARP的解离，将PARP捕获在受损的单链DNA处形成DNA-PARP复合物，无法脱离的DNA-PARP复合物引起复制叉的崩溃，随后DNA单链损伤转化成更严重的双链断裂。此时细胞可通过精度更高的同源重组（homologous recombination，HR）修复受损的DNA双链；但如果细胞本身存在HR缺陷，双链损伤的修复转而依赖易出错的非同源重组末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）将断裂的DNA两端直接连接，引起基因组的不稳定性加剧并诱导细胞凋亡^[5]。PARPi的这种依赖HR缺陷引起的细胞毒效应称为合成致死（synthetic lethal）。因此，肿瘤细胞的HR缺陷是PAPRi治疗的基础。

BRCA1/2突变与乳腺癌的发生最为密切，也是引起乳腺癌HR修复缺陷最常见原因。携带胚系BRCA1/2基因突变的人群中乳腺癌发病率约为普通人群的10倍^[6-7]，乳腺癌患者约有5%存在BRCA1/2胚系基因突变^[8]，在TNBC中这个比例可达10%^[9]。这类存在HR缺陷的BRCA基因突变的乳腺癌患者是PARPi的主要适应人群。然而PARPi用于乳腺癌的治疗目前仍处于起步阶段，美国FDA批准用于乳腺癌的PARPi只有olaparib和talazoparib，而我国尚未批准其用于乳腺癌的治疗。PARPi在临床上已取得许多令人瞩目的成绩，在olaparib的Ⅲ期临床试验中纳入的胚系BRCA突变的人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）阴性的转移性乳腺癌olaparib治疗后的总缓解率为59.9%，中位无进展生存期为7.0个月，而接受标准单药化疗（卡培他滨、艾日布林或长春瑞滨）的患者为28.8%和4.2个月^[8]。在talazoparib的Ⅲ期临床试验中，talazoparib的缓解率为62.6%，中位无进展生存期为8.6个月，而接受标准单药化疗（卡培他滨、艾日布林、吉西他滨或长春瑞滨）的患者分别为27.2%和5.6个月^[10]。与没有BRCA基因突变的肿瘤患者比较，PARPi在BRCA突变的卵巢癌、乳腺癌和肠癌等患者中有着更好的疗效，但仍有40%至70%的患者对PARPi无反应，且多数接受治疗的患者最终都产生获得性耐药并出现肿瘤复发^[11]。

2 PARPi在乳腺癌中的耐药性研究

根据PARPi的作用机制，在使用PARPi情况下，细胞恢复其DNA单链或双链的修复能力就可能逆转合成致死效应，导致耐药的出现。目前已发现几种PARPi耐药的发生机制，主要包括：HR功能的恢复、药物外排增加、PARP表达减少、聚腺苷二磷酸核糖水解酶[poly（ADP-ribose）glycohydrolase，PARG]水平下调以及复制叉保护等。

2.1 HR修复功能恢复与PARPi耐药

HR功能部分或全部恢复可以导致PARPi的耐药性^[12]。HR修复功能恢复机制中最常见的是BRCA1/2的逆转突变（reversion mutation）。此外，HR的上下游其他因子的功能改变也可引起HR修复功能恢复并导致PARPi耐药，这为逆转PARPi耐药提供重要思路。

2.1.1 BRCA基因的逆转突变与PARPi耐药

引起HR功能恢复最常见的机制是BRCA基因的逆转突变。由BRCA基因编码的BRCA1和BRCA2蛋白是介导HR修复的最重要的蛋白。BRCA1在DNA修复中具有识别DNA损伤、检查点激活和募集DNA修复蛋白等多种功能，BRCA2则介导Rad51募集至双链DNA断裂处进行HR修复。携带BRCA基因突变的乳腺癌患者无法正常编码BRCA1/2。在长期使用PARPi的患者中，PARPi所导致的基因组不稳定性的增加会诱导肿瘤细胞出现BRCA的逆转突变，随后基因开放阅读框功能恢复重新编码BRCA1/2，最终引起HR恢复并产生PARPi抵抗^[13]。有队列研究纳入5例证实有BRCA1/2缺陷并且对PARPi存在获得性耐药的转移性乳腺癌患者，其中3例出现明确或者部分的BRCA基因开放阅读框恢复，并且这3例耐药患者产生耐药后均出现Rad51焦点（foci），表明BRCA1/2的逆转突变可导致HR恢复并引起PARPi耐药^[14]。一项队列研究利用循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）评估乳腺癌患者BRCA的逆转突变与患者PARPi耐药的相关性，发现其中2例（40%）中出现多样化且通常为多克隆的BRCA2的逆转突变，1例（20%）出现逆转突变的患者经PARPi治疗后出现血浆中BRCA2逆转突变的富集^[15]。上述研究说明，BRCA1/2的逆转突变可引起乳腺癌患者HR修复功能的恢复并导致PARPi的耐药，由于研究样本量较少，结论仍需进一步验证。

2.1.2 BRCA1亚型蛋白和基因去甲基化与PARPi耐药

在耐PARPi的BRCA1/2缺陷的肿瘤细胞中发现，BRCA1外显子的突变可引起截短的BRCA1亚型蛋白的表达，这类蛋白缺乏C端与DNA结合的结构域，但仍保留与HR蛋白PALB2-BRCA2-Rad51相互作用所必需的蛋白结构域，当以足够高的水平表达时，可引起HR并对PARPi产生耐药^[16]。研究发现，在耐PARPi的BRCA1突变的乳腺癌人源肿瘤异种移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）模型中未能检测到框内的逆转突变，但在60%的模型中存在BRCA1亚型蛋白表达和Rad51焦点，说明除了BRCA基因突变外，诱导BRCA亚型蛋白的表达同样可引起HR恢复^[17]。在BRCA1突变的TNBC细胞及PDX模型中，HR上游的细胞周期蛋白依赖性激酶12（cyclin-dependent kinase 12，CDK12）的抑制剂dinaciclib可通过抑制由BRCA1亚型蛋白介导的残留HR功能，逆转veliparib的耐药现象，从而抑制肿瘤的复发；此外还能使BRCA野生型的TNBC细胞对veliparib敏感^[18]。此外，BRCA基因的去甲基化也可引起肿瘤细胞对PARPi耐药。BRCA1基因启动子甲基化的肿瘤细胞株对olaparib等PARPi的敏感性增加；而BRCA1基因启动子的去甲基化可引起BRCA1缺陷的乳腺癌细胞恢复BRCA1的表达并引起PARPi及化疗药物耐药^[19]。由此可见，BRCA1亚型蛋白的产生和BRCA1去基因甲基化也是引起PARPi耐药的重要原因。

2.1.3 DNA末端切除抑制状态解除与PARPi耐药

在DNA双链损伤的初期，p53结合蛋白1（p53-binding protein，53BP1）和REV7等阻止DNA末端切除的蛋白迅速定位到损伤的染色质上抑制HR的进行；而BRCA1则通过将53BP1从DNA损伤周围的染色质中置换出来激活DNA的末端切除，这是HR修复的关键步骤。如果53BP1出现缺失则可引起DNA末端暴露，促进BRCA1缺陷的肿瘤细胞恢复HR功能并对PARPi产生抗药性。研究发现，PARPi simmiparib在BRCA1缺陷的MDA-MB-436乳腺癌细胞中的抑制率为74.2%，而在53BP1和BRCA1双缺乏的细胞中抑制率仅为7.8%；在双缺乏的细胞中通过重新表达53BP1可恢复PARPi的敏感性^[20]；与早前的研究结果一致^[21]，说明53BP1的缺失可引起BRCA1突变的乳腺癌细胞对PARPi产生耐药。研究发现，olapaparib可诱导乳腺癌细胞株HR上游的共济失调毛细血管扩张突变（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）出现磷酸化并激活效应子Chk2，随后引起Rad51上调并导致HR功能恢复^[22]。而在ATM功能缺陷的细胞中敲除53BP1则出现较高水平的ATM磷酸化、Chk2和Rad51，证明HR活性再次得到恢复。这说明，53BP1的缺失引起ATM的磷酸化并且部分恢复细胞的HR。然而，有研究发现，53BP1耗竭对存在低水平BRCA1亚型蛋白的BRCA1突变型乳腺癌细胞HCC1395、SUM135MO2和MDA-MB-436的PARPi耐药性仅产生轻微影响^[23]。进一步通过CRISPR/Cas9敲除53BP1基因，SUM149PT细胞对PARPi产生耐药性，但对MDA-MB-436细胞的耐药无明显影响。这些研究结果的不一致可能与研究的BRCA1突变的细胞株和生物体的遗传背景的差异有关。

53BP1下游的REV7也是阻断DNA末端切除的关键蛋白。REV7的缺失会导致BRCA1缺陷的乳腺癌细胞重新建立carboxyl-terminal binding protein（CtBP）依赖的DNA双链损伤末端切除，从而导致HR恢复和PARPi耐药^[24]。近期一项研究确定了一种包含REV7的复合物Shieldin的缺失会促进BRCA2/Rad51负载到损伤处并启动DNA末端切除，最终导致HR恢复，产生PARPi的耐药^[25]。这个复合物包含C20orf196（SHLD1）、FAM35A（SHLD2）、CTC-534A2.2（SHLD3）和REV7，具有保护DNA末端和促进NHEJ的功能。目前已经证实，在原发性和获得性PARPi耐药的人类乳腺癌细胞中出现SHLD1/2表达降低^[26]。REV7存在于活跃的“封闭”构象和非活跃的“开放”构象，肿瘤细胞内甲状腺激素受体相互作用因子13（thyroid hormone receptor interactor 13，TRIP13）催化失活的构象变化，从而使REV7-Shieldin分解以促进DNA末端切除，增强PARPi抵抗力^[27]。而TRIP13通常在乳腺癌中过表达，并与不良预后相关。以上研究说明，REV7及其复合物的下调能够导致乳腺癌细胞对PARPi耐药。

2.1.4 Rad51水平升高与PARPi耐药

Rad51的核焦点是HR功能的标志，是介导DNA末端切除的主要的蛋白，参与HR修复。研究发现，Rad51的升高可引起TNBC的PARPi耐药^[17]；而抑制乳腺癌细胞Rad51可提高PARPi的敏感性^[28]。长期使用PARPi处理的耐PARPi的BRCA1突变TNBC细胞，其Rad51活性比亲代细胞更高，表现出对PARPi的敏感性降低，这种作用与上游的BRCA1/2的表达无明显关系^[29]。在接受olaparib治疗的TNBC中有出现降解Rad51的早期有丝分裂抑制因子1（early mitotic inhibitor 1，EMI1）的缺失，Rad51的抑制被解除，挽救了HR并赋予PARPi耐药，而Chk1和ATR抑制剂则可能通过促进EMI1介导的Rad51降解而使细胞对PARPi敏感^[30]。这说明，Rad51升高所产生的耐药性受到其上游调控因子的影响。

2.2 药物外排机制与PARPi耐药

多药耐药（multidrug resistance，MDR）基因在多种肿瘤患者中表达增加并导致患者对许多抗肿瘤药物耐药。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp，或称为Abcb1）是由MDR1编码的跨膜糖蛋白，其通过消耗ATP将药物排出细胞外，导致在肿瘤细胞内的浓度降低，进而引起耐药。有研究报道，在PARPi耐药的乳腺癌细胞中P-gp的表达上调，与其耐药性相关；通过联合P-gp抑制剂可提高PARPi的水平^[31]。Talazoparib固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）制剂可通过克服由多药耐药蛋白1（multidrug resistance protein 1，MRP1）和乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）过表达引起的药物外排泵的作用，增强talazoparib在TNBC细胞中的细胞内蓄积，减轻其耐药性^[32]。然而在BRCA2突变耐药乳腺癌小鼠模型中，P-gp的上调并不足以引起olaparib的耐药性，抑制P-gp并不能解除PARPi的耐药性^[33]。另外一项研究发现，抑制P-gp可延长BRCA1缺陷型乳腺肿瘤小鼠对olaparib的反应，但肿瘤仍会产生耐药性^[21]。体外研究发现，在PARPi耐药的乳腺癌细胞中，未检测到P-gp过度表达的基因融合现象^[14]。从这些不一致的研究结果来看，P-gp的上调可能只是某些抗药性肿瘤的特征而不是作为耐药性产生的一个机制^[34]。其他药物外排蛋白如Abcg2/BCRP影响PARPi的疗效也有报道^{[32, 35]}，但与PARPi耐药性是否相关仍有待进一步研究。

2.3 PARP的水平与PARPi耐药

目前一些研究认为，PAPR1的过表达是乳腺癌的一个不良预后因素^[36]，但对PARP表达水平与乳腺癌PARPi的耐药性的研究仍较少。研究显示，乳腺癌干细胞的PARP1过表达与olaparib的耐药有关，可能由于PARP1过表达提高乳腺癌干细胞的DNA修复能力，有利于对DNA损伤治疗产生抵抗^[37]。然而，有研究指出，PARP1基因突变细胞对olaparib的抗性比野生型细胞高100倍，对talazoparib也存在较强的抗性^[38]。研究发现，PARP1与DNA结合的锌指结构域内外部的突变均可引起PARPi耐药；PARP基因突变在BRCA1缺陷的乳腺癌细胞SUM149中产生PARPi抗性；体内实验进一步证实，Talazoparib抑制乳腺癌异种肿瘤移植物的生长并延长小鼠的存活期（P=0.009），而在携带PARP1突变的异种移植物的小鼠中talazoparib没有显示出相应的作用（P=0.98），说明PARP1基因的突变可以导致PARPi的耐药；值得注意的是，该实验还发现某些对PARPi敏感的BRCA1突变肿瘤细胞可以耐受PARP1突变，表明在这些肿瘤细胞中，PARP1诱捕可能仍然是PARPi细胞毒性增加的基础，但是某些残留的BRCA1功能使这些细胞能够耐受PARP1突变^[39]。

2.4 PARG耗竭与PARPi耐药

PARP1结合到受损的DNA单链中引起PAR糖基化（PARylation）并产生PAR聚合物的过程是DNA修复的重要步骤。PARG将PAR聚合物糖链降解，使PAR糖基化短暂可逆。肿瘤细胞内PARPi不能完全阻断PARP的活性，一旦PARG活性丧失足以逆转PAR聚合物的结构和功能，恢复下游的DNA修复蛋白的募集作用，有效地调控复制叉的延展，使DNA修复得以进行并产生PARPi的耐药性。PARPi耐药的BRCA2缺乏型乳腺癌细胞中表现出降解PAR聚合物的能力降低，内源性PAR聚合物水平升高；进一步通过遗传性及化学抑制的方法验证了PARG的缺失恢复下游支架蛋白XRCC1的募集，保护受控的复制叉，并减少DNA损伤^[40]。耗尽PARG可以恢复PARPi处理的U-2 OS细胞株中的PAR水平，同时捕获的PARP1或PARP2无明显减少，表明PARG的耗竭会影响PARPi阻断细胞PAR糖基化的效率^[41]。由此可见PARG耗竭是引起PARPi耐药的一个机制，而这种耐药机制在TNBC和浆液性卵巢癌中较为常见。

2.5 复制叉稳定性的恢复与PARPi耐药

BRCA1/2在DNA复制过程中起到保护复制叉的作用。BRCA2缺陷的细胞中，耐药性是通过促进复制叉的稳定性以及防止停滞的复制叉出现核酸降解来实现的；在长期olaparib治疗的细胞中转录调节因子E2F7水平降低，敲除E2F7的BRCA2缺乏的乳腺癌细胞中，原本对olaparib敏感的细胞出现耐药，这可能是由于E2F7的耗竭增加Rad51水平，保护停滞的复制叉免受MRE11介导的降解作用^[42]。此外，有研究指出，在乳腺基底样癌细胞株中，Chk1抑制剂与olaparib具有很强的协同作用，可增加基因组的不稳定性，这可能与E2F7的抑制作用被解除而丧失其复制叉保护能力有关^[43]。

3 结语

分子研究及靶向治疗的研究对乳腺癌治疗非常重要，而耐药性的产生极大限制了PARPi的应用和推广。大量研究就此提出多种假说并且尝试通过联合用药策略或寻求BRCA突变以外的潜在机制来改善乳腺肿瘤细胞对PARPi的敏感性，遗憾的是多数研究仍局限于体内体外实验，临床研究十分匮乏。尽管如此，PARPi在乳腺癌的治疗中仍有广阔的应用前景，希望未来有更多的临床和基础研究阐明这些不同的PARPi耐药机制及其与临床的相关性。本文基于目前的研究概述了PARPi的作用机制以及在乳腺癌耐药中复杂分子机制的最新进展，希望为临床应用及克服耐药提供思路。