甲状腺乳头状癌是一种临床病理性异质性疾病^[1]。虽然在完成甲状腺切除术后，多数甲状腺乳头状癌可以通过放射性碘和左旋甲状腺素组合成功治疗，但具有更强侵袭性表型的甲状腺乳头状癌与发病率和死亡率相关^[2-3]。因此，了解甲状腺乳头状癌的发生和发展所涉及的分子事件将有助于早期诊断、预后和治疗靶点的研究^[4]。除蛋白质编码基因的改变外，非蛋白质编码基因的异常也可能导致癌症发病机制^[5-6]。微小RNA（microRNA，miRNA）是非蛋白质编码RNA，通过与靶mRNA的3个非翻译区结合并引起mRNA的翻译或降解而对基因表达发挥正调节剂的作用^[7]。实际上，miRNA还涉及多种细胞过程的调节，包括细胞凋亡、造血分化和转移。这些miRNA可在各种癌症中起肿瘤促进因子或癌基因的作用。甲状腺乳头状癌组织较正常甲状腺组织miRNA表达异常增加，特别是miR-222、miR-221和miR-146b。这些数据表明miRNA特征与PTC相关，并且miRNA失调是甲状腺细胞转化中的重要事件^[8]。miR-182过表达不仅与肝癌的发生有关，而且能促进肝癌侵袭；在患有三阴性散发性乳腺癌的患者中，通过miR-182上调乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）导致乳腺细胞株的细胞增殖增加。在组织微阵列实验中，miR-182被证明是口腔鳞状细胞癌患者的不良预后标志物^[9]。目前关于miR-182表达与甲状腺乳头状癌临床病理特征的研究较少，本研究拟探讨甲状腺乳头状癌组织中miR-182表达情况及其与临床病理特征的相关性，为其早期诊断及治疗提供参考。

1 资料与方法 1.1 一般资料

本院肿瘤外科2010年4月至2013年7月确诊并有完整随访资料的甲状腺乳头状癌患者98例，均经临床颈部超声诊断以及甲状腺全切除或次全切除术后病理检查证实，术前均未接受过化疗或放疗。其中，男性40例，女性58例；年龄47~68岁，（57.5±10.8）岁；病程4~25个月。选择该98例癌旁组织（癌旁组织均距肿瘤切缘 > 2 cm）作为对照组。患者自愿提供甲状腺癌组织及癌旁组织，用作分析miR-181的表达。本研究经本院医学伦理协会批准，患者及家属签署知情同意书。

纳入标准：符合临床诊断标准；年龄≥18岁；既往无精神障碍史；患者/亲属签署知情同意书。排除标准：合并其他肿瘤患者；肝肾功能不全者；临床资料不完整者；存在其他重大器官疾病者。

1.2 主要仪器及试剂

BisulFlash DNA Modification Kit购自大连宝生物生物科技有限公司。实时荧光定量PCR仪购自美国BIO-RAD公司。

1.3 miR-182 mRNA水平的测定

定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）检测甲状腺乳头状癌组织及癌旁组织中miR-182的表达。用TRIzol（Life Technologies，美国）提取0.3 g甲状腺癌组织及癌旁组织总RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒（Invitrogen Life Technologies，USA）产生第一链互补cDNA。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）进行标准化（GAPDH正向引物为5' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3' ；反向引物为5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' ）。PCR引物的序列中，miR-182正向引物为5' -CTTGCTATACAAGGGCAAGCACGAA-3' ，反向引物为5' -CTTGAGTACGACCAAATCCCGTC-3。将2 μL RNA与1 μL oligo（dT）和10 μL无RNase的去离子水混合，在PCR机中在70℃下孵育5 min并立即在冰上冷却。通过加入4 μL 5×缓冲液，2 μL 10 mmol/L脱氧核糖核苷酸三磷酸，1 μL RNA抑制剂和1 μL反转录酶诱导cDNA合成，然后在PCR机中于42℃温育1 h。通过在70℃温育5 min终止反应。使用THUNDERBIRD SYBR^®qPCRMix试剂盒（Toyobo Co，Ltd，日本）进行定量测量。对于PCR，将12.5 μL 2×qPCR Mix、2.0 μL每种引物（2.5 μmol/L）、2.0 μL cDNA和8.5 μL双蒸水加入0.2 mL PCR管中。扩增条件包括40个循环，95℃15 min，95℃15 s，55℃30 s，72℃25 s。然后将反应保持在4℃。使用阈值循环（Ct）的值确定每个靶基因的mRNA表达。在与GAPDH比较后使用2^-ΔΔCT方法计算相对表达。

1.4 随访

随访起始日期为术后第1天，随访截止日期为2016年6月，中位随访时间为2.9年。随访方式为门诊与电话结合随访，随访内容为生活质量、病情变化、治疗效果和恢复情况等，失访率为0.0%。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件分析数据。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验。计数资料采用频数（百分比）表示，组间比较采用χ²检验。采用Kaplan-Meier法作生存曲线分析。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 miR-182水平

甲状腺乳头状癌组miR-182表达水平高于对照组，差异具有统计学意义[（1.89±0.48）vs（0.66±0.21），t=11.541，P < 0.01]。

2.2 miR-182表达与临床病理特征及化疗敏感性的关系

以甲状腺乳头状癌组miR-182水平的均数1.89为判定点，< 1.89为阴性，≥1.89为阳性。miR-182表达在年龄方面比较，差异无统计学意义（χ²=1.364，P > 0.05，表 1）。病理学分期高、TNM分期高、浸润深度深、淋巴血管间隙浸润和淋巴结转移的甲状腺乳头状癌患者miR-182阳性表达率越高，差异均具有统计学意义（均P < 0.01）。

2.3 miR-182水平与甲状腺乳头状癌患者预后分析

miR-182阳性组3年生存率低于miR-182阴性组，差异具有统计学意义（27.9% vs 80.0%，P < 0.01，图 1）。

3 讨论

本研究分析98例甲状腺乳头状癌组织和对应癌旁组织样本中的miR-182表达水平。结果表明，与癌旁组织比较，miR-182水平在甲状腺乳头状癌组织中上调。miR-182是miR-17-82家族的成员。miR-17-82家族是最具特征的致癌miR簇之一。miR-182在许多人类癌症中上调，如肾癌、胃癌、肝细胞癌、子宫颈癌、结直肠癌和膀胱癌。miR-182在远处转移的微创滤泡性甲状腺癌中高度上调^[10-11]。乳腺癌进展过程中微切割上皮细胞中miR-182水平上升，正常乳腺上皮细胞水平最低，原位导管癌增加，浸润性乳腺组织最高^[12]。在胃癌中，使用miRNA锁定核酸原位杂交检测出miR-182在胃癌组织表达增加。miR-182通过下调特异性抗增殖和（或）促凋亡基因[包括B-细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤-2样11（B-cell chronic lymphocytic leukemia/lymphoma-2 like 11，BCL2L11）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）]的表达，在细胞内发挥其致癌作用。miR-182的过表达可能对某些环境中的癌细胞有利^[13]。在多种肿瘤类型中观察到13q31.3位点的杂合性缺失，并且癌症中拷贝数改变的全基因组分析显示miR-182在16.5%的卵巢癌、21.9%的乳腺癌和20%的黑色素瘤中过度表达^[14]。c-fos原癌基因受miR-182的调控^[15]。而甲状腺乳头状癌中的c-fos高表达与甲状腺外扩张、淋巴结转移、晚期肿瘤分期、疾病复发甚至患者病死率密切相关。此外，c-fos高表达是复发和持续性疾病的独立预后因素。miR-146高表达促进甲状腺乳头状癌进展和侵袭的分子机制包括主要肿瘤抑制基因和甲状腺碘代谢基因的下调和癌症促进分子的上调，如血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和c-Met^[16]。miR-146高表达已被证明可增强甲状腺转基因小鼠的致瘤能力。对大鼠甲状腺细胞株的研究表明，miR-146高表达促进PCCL3细胞株中的致癌基因质粒^[17-18]。本研究也显示，甲状腺乳头状癌组miR-182表达水平高于对照组；病理学分期高、TMN分期高、浸润深度深、淋巴血管间隙浸润和淋巴结转移患者的miR-182阳性表达率高；提示miR-182具有促进甲状腺乳头状癌分化、侵袭和迁移的作用。

增加对细胞凋亡的抵抗力是多数癌症的标志性改变，miR-182在对化疗相对不敏感的非小细胞肺癌细胞的抗凋亡中起重要作用。非小细胞肺癌细胞中miR-182的异位表达增强其对多柔比星或多西紫杉醇诱导的细胞凋亡的抗性，而用短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）抑制miR-182表达消除非小细胞肺癌细胞抵抗细胞毒性试剂诱导的细胞死亡的能力。结合本次研究预后分析发现，miR-182阳性组3年生存率及生存期均低于miR-182阴性组，提示miR-182低表达的甲状腺乳头状癌患者能获得较好的预后。这可能与miR-182增加甲状腺乳头状癌抗化疗有关，其具体分子机制将在后续研究进行。

综上所述，甲状腺乳头状癌中miR-182表达升高，miR-182在甲状腺乳头状癌的发生和发展过程中起促进作用；miR-182低表达的甲状腺乳头状癌患者能获得较好的预后。