全球范围内，肺癌是发病率排名第2位（仅次于乳腺癌）且死亡率位列第1位的恶性肿瘤。据预测，2020年，全球新诊断的肺癌患者约220万例，死亡病例高达179万例^[1]。得益于手术、放疗和化疗等治疗手段的发展，近年来肺癌预后得到一定提升^[2-4]。然而，诊断延误等问题导致肺癌患者生存率较低，尤其是晚期肺癌患者（5年生存率≤15%）^[4-5]。更糟糕的是，多数肺癌患者确诊时已为晚期，给治疗带来巨大挑战。非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）是最常见的肺癌病理亚型，占肺癌总病例的80%以上^[5-6]，主要为肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）。因此，开展NSCLC相关的研究探索可用于早期诊断肺癌的生物标志物尤为重要。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类非编码RNA分子，可参与细胞的增长、分化及凋亡等多种生物学进程^[7]。目前已有多种miRNA被指出在肿瘤中发挥重要作用，并具有明显的临床价值。有学者指出，通过检测血浆中外泌体的let-7d-3p和miR-30d-5p表达水平可以早期诊断子宫颈癌^[8]。而血清中的miR-1290表达水平则被认为是食管鳞癌患者预后不良的标志，且该分子可以区分食管鳞癌患者和健康人群^[9]。let-7b-5p被认为与肿瘤的发生和发展密切相关。例如，该miRNA在多发性骨髓瘤组织及细胞株中均被报道低表达，且其表达上调可抑制肿瘤细胞增殖^[10]。let-7b-5p也在肺类癌中低表达^[11]。然而，目前let-7b-5p在NSCLC组织中高表达^[12]或低表达^[13]尚存争议，且未见相关研究揭示其在NSCLC患者血液中存在表达差异以及是否可用于诊断NSCLC患者。因此，有必要进一步探讨let-7b-5p在NSCLC中的表达水平以及诊断价值。

本研究通过检索Gene Expression Omnibus (GEO)、ArrayExpress、The Cancer Genome Atlas (TCGA)和PubMed等数据库，采集来自多中心的样本数据，探索let-7b-5p在NSCLC患者血液中的表达水平。同时，通过受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线评判let-7b-5p诊断NSCLC的效能，并综合多种方法探索let-7b-5p在NSCLC中的潜在靶基因和相关靶基因在NSCLC中的诊断价值。

为获取全球范围内的多中心样本，截至2021年12月22日，通过检索上述GEO、ArrayExpress、Sequence Read Archive、ONCOMINE、TCGA、PubMed、中国知网、万方数据以及重庆维普9个数据库，筛选NSCLC相关的逆转录定量聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)及高通量数据。检索式关键词为“lung cancer, microRNA”。数据纳入标准：（1）试验组样本获取自NSCLC患者；（2）血液样本；（3）包含miRNA表达数据。排除标准：（1）表达数据缺失；（2）重复样本。最终，4个高通量原始数据集GSE27486、GSE40738、GSE152702及GSE171517（均来自GEO数据库）符合标准，共包含145例NSCLC患者血液样本（NSCLC组）和83位健康人血液样本（对照组）。根据NSCLC亚型将4个原始数据集拆分为7个数据集：4个LUAD相关数据集（LUAD-GSE27486、LUAD-GSE40738、LUAD-GSE152702和LUAD-GSE171517）以及3个LUSC相关数据集（LUSC-GSE40738、LUSC-GSE152702和LUSC-GSE171517）。其中，源自同一个原始数据集的LUAD数据集和LUSC数据集共用该原始数据集中的对照组样本。例如，LUAD-GSE40738和LUSC-GSE40738共用原始数据集GSE40738中的58例对照组样本。基于这些数据，分LUAD和LUSC两种亚型探索NSCLC组与对照组间的let-7b-5p表达差异。为探索let-7b-5p在NSCLC中的潜在靶基因，于2022年1月5日从Genomic Data Commons数据库（该数据库存储TCGA的最新数据）分别下载LUAD和LUSC组织样本的转录组测序数据集。

采用R（v4.1.0）的ggplot2、ggsignif以及meta程序包，通过小提琴图、箱型图以及森林图比较NSCLC组和对照组let-7b-5p表达水平差异。采用Wilcoxon秩和检验和标准化均数差（standardized mean difference, SMD）分析两组间let-7b-5p表达水平差异。SMD的95% CI不包含0提示SMD结果差异具有统计学意义；其余情况下，以P < 0.05为差异具有统计学意义。通过ROC曲线及综合ROC（summary ROC，SROC）曲线的曲线下面积（area under the curve, AUC）评估let-7b-5p诊断NSCLC的效能。AUC > 0.5且 < 0.7提示低准确度，AUC≥0.7且 < 0.9提示中等准确度，AUC≥0.9提示高准确度。诊断性meta分析的敏感度和特异度也用于检测let-7b-5p诊断NSCLC的效能。除了SROC曲线和诊断性meta分析森林图于Stata（v15.0）软件绘制外，其余计算及绘图过程均借助R（v4.1.0）软件完成。

TargetScan通过寻找与每个miRNA种子区相匹配的3种保守性位点（8mer、7mer和6mer）预测miRNA的生物学靶点^[14-15]。miRDB基于高通量测序实验数据和计算生物学方法预测miRNA的靶点，预测5种物种（人类、小鼠、大鼠、狗和鸡）的miRNA靶基因供研究者参考^[16]。miRTarBase数据库的开发团队手工整理miRNA功能实验相关的文献，于miRTarBase数据库中存放≥36万条miRNA-靶基因的相互作用的信息^[17]。2022年1月6日分别从TargetScan (v8.0)、miRDB以及miRTarBase数据库中获取let-7b-5p的预测靶基因。同时，根据TCGA数据库中的LUAD和LUSC组织样本的转录组测序数据集分别计算这2种疾病的上调基因（upregulated genes, UGs）。UGs的筛选借助R（v4.1.0）的limma程序包完成，筛选条件为：log₂(fold change)≥1且校正P值< 0.05。运用韦恩图将预测靶基因以及LUAD和LUSC的UGs取交集获取let-7b-5p的潜在靶基因^[18]，并运用Cytoscape（v3.9.0）软件绘制网络图展示let-7b-5p及其潜在靶基因。通过ROC曲线的AUC评估let-7b-5p的潜在靶基因区分NSCLC组织样本和正常肺组织样本的能力，方法及判定标准同1.2。

LUAD-GSE152702、LUAD-GSE27486以及LUAD-GSE40738数据集显示let-7b-5p在LUAD组的血液中表达低于对照组（均P < 0.05，图 1A）。LUSC-GSE152702数据集显示，与对照组比较，LUSC患者的血液中let-7b-5p表达更低（P < 0.05，图 1A）。进一步亚组分析显示，let-7b-5p在LUAD组（SMD=-0.53，95% CI: -0.84~-0.21）及LUSC组（SMD=-0.47，95% CI: -0.84~-0.09）血液中低表达（图 1B）。LUAD和LUSC汇总分析表明，let-7b-5p在NSCLC组血液中的表达水平较对照组低（SMD=-0.50，95% CI: -0.75~-0.26；图 1B）。

注  A：小提琴图和箱型图比较let-7b-5p在LUAD组、LUSC组与对照组中的表达差异；B：森林图比较let-7b-5p在LUAD组、LUSC组、NSCLC组与对照组中的表达差异；LUAD：肺腺癌（lung adenocarcinoma）；LUSC：肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma）；NS：not significant（P > 0.05）；*P < 0.05；**P < 0.01 图 1 在LUAD-GSE152702、LUAD-GSE171517、LUAD-GSE27486、LUAD-GSE40738、LUSC-GSE152702、LUSC-GSE171517和LUSC-GSE40738数据集中NSCLC组及对照组let-7b-5p表达水平比较 Fig.1 Comparison of let-7b-5p expression between NSCLC group and control group based on the datasets of LUAD-GSE152702, LUAD-GSE171517, LUAD-GSE27486, LUAD-GSE40738, LUSC-GSE152702, LUSC-GSE171517, and LUSC-GSE40738

图选项

ROC曲线分析显示，let-7b-5p诊断LUAD和LUSC的准确度均为低~中等（LUAD：AUC=0.556~0.844，LUSC：AUC=0.570~0.836；图 2A）。整合LUAD和LUSC数据集的SROC曲线显示，let-7b-5p诊断NSCLC的准确度为中等（AUC=0.79，图 2B）；森林图的敏感度和特异度均 > 0.7，表明let-7b-5p可以区分NSCLC患者和健康人（图 2C）。

注  A：ROC曲线评估let-7b-5p诊断LUAD以及LUSC的效能；B：SROC曲线评估let-7b-5p诊断NSCLC的效能；C：敏感度及特异度森林图评估let-7b-5p诊断NSCLC的效能；LUAD：肺腺癌（lung adenocarcinoma）；LUSC：肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma）；AUC：曲线下面积（area under the curve）；SROC：综合受试者工作特征（summary receiver operating characteristic） 图 2 在LUAD-GSE152702、LUAD-GSE171517、LUAD-GSE27486、LUAD-GSE40738、LUSC-GSE152702、LUSC-GSE171517以及LUSC-GSE40738数据集中let-7b-5p诊断NSCLC患者的效能评估 Fig.2 Evaluation of the efficacy of let-7b-5p in diagnosing NSCLC patients based on the datasets LUAD-GSE152702, LUAD-GSE171517, LUAD-GSE27486, LUAD-GSE40738, LUSC-GSE152702, LUSC-GSE171517, and LUSC-GSE40738

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分别从TargetScan、miRDB和miRTarBase数据库中获取1 207、990和1 113个let-7b-5p的预测靶基因。根据TCGA数据库中的LUAD和LUSC测序数据集分别计算出1 286和1 976个UGs。将预测靶基因和LUAD-UGs及LUSC-UGs交集得到10个let-7b-5p的潜在靶基因（图 3A）。这10个潜在靶基因分别为：碱性亮氨酸拉链和W2结构域2（basic leucine zipper and W2 domains 2，BZW2)、细胞分裂周期蛋白25A（cell division cycle 25A，CDC25A）、细胞分裂周期相关基因8（cell division cycle associated 8, CDCA8）、Ⅲ型胶原α-1链（collagen type Ⅲ alpha 1 chain，COL3A1）、外纺锤体极样蛋白1（extra spindle pole bodies like 1，ESPL1）、高迁移率族AT-hook蛋白1（high mobility group AT-hook 1，HMGA1）、胰岛素样生长因子2结合蛋白3（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 3，IGF2BP3）、NME/NM23核苷二磷酸激酶4（NME/NM23 nucleoside diphosphate kinase 4，NME4）、葡萄糖磷酸变位酶2样蛋白1（phosphoglucomutase 2 like 1，PGM2L1）以及核糖核苷酸还原酶调节亚基M2（ribonucleotide reductase regulatory subunit M2，RRM2；图 3B）。let-7b-5p在NSCLC的10个潜在靶基因均具有中等至高准确度来区分LUAD与正常肺样本（AUC=0.765~0.980）以及LUSC与正常肺样本（AUC=0.749~0.997；图 4）。

注  A：韦恩图筛选let-7b-5p在NSCLC中的潜在靶基因；B：let-7b-5p的潜在靶基因；LUSC：肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma）；UGs：上调基因（upregulated genes）；LUAD：肺腺癌（lung adenocarcinoma）；HMGA1：高迁移率族AT-hook蛋白1（high mobility group AT-hook 1）；ESPL1：外纺锤体极样蛋白1（extra spindle pole bodies like 1）；RRM2：核糖核苷酸还原酶调节亚基M2（ribonucleotide reductase regulatory subunit M2）；CDCA8：细胞分裂周期相关基因8（cell division cycle associated 8）；CDC25A：细胞分裂周期蛋白25A（cell division cycle 25A）；IGF2BP3：胰岛素样生长因子2结合蛋白3（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 3）；BZW2：碱性亮氨酸拉链和W2结构域2（basic leucine zipper and W2 domains 2)；PGM2L1：葡萄糖磷酸变位酶2样蛋白1（phosphoglucomutase 2 like 1）；NME4：NME/NM23核苷二磷酸激酶4（NME/NM23 nucleoside diphosphate kinase 4）；COL3A1：Ⅲ型胶原α-1链（collagen type Ⅲ alpha 1 chain） 图 3 let-7b-5p在NSCLC中的潜在靶基因筛选 Fig.3 Screening of potential target genes of let-7b-5p in NSCLC

图选项

注  LUAD：肺腺癌（lung adenocarcinoma）；BZW2：碱性亮氨酸拉链和W2结构域2（basic leucine zipper and W2 domains 2）；AUC：曲线下面积（area under the curve）；CDC25A：细胞分裂周期蛋白25A（cell division cycle 25A）；CDCA8：细胞分裂周期相关基因8（cell division cycle associated 8）；COL3A1：Ⅲ型胶原α-1链（collagen type Ⅲ alpha 1 chain）；ESPL1：外纺锤体极样蛋白1（extra spindle pole bodies like 1）；HMGA1：高迁移率族AT-hook蛋白1（high mobility group AT-hook 1）；IGF2BP3：胰岛素样生长因子2结合蛋白3（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 3）；NME4：NME/NM23核苷二磷酸激酶4（NME/NM23 nucleoside diphosphate kinase 4）；PGM2L1：葡萄糖磷酸变位酶2样蛋白1（phosphoglucomutase 2 like 1）；RRM2：核糖核苷酸还原酶调节亚基M2（ribonucleotide reductase regulatory subunit M2）；LUSC：肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma） 图 4 ROC曲线评估let-7b-5p在NSCLC中的10个潜在靶基因区分LUAD及LUSC与正常肺样本的效能 Fig.4 Efficacy of the 10 potential target genes of let-7b-5p in screening LUAD and LUSC samples from normal lung samples evaluated by ROC curves

图选项

肺癌是发病率和死亡率均排名前列的癌症。≥50%的肺癌患者确诊时已至晚期，患者5年生存率不容乐观^[4-5]。目前已有多种治疗手段使早期肺癌患者获益，故探索可用于早期诊断肺癌患者的生物标志物具有重要意义。

本研究首次揭示let-7b-5p在NSCLC患者血液中低表达。let-7b-5p的低表达状态在多种癌组织中被报道，如多发性骨髓瘤以及乳腺癌等^{[10, 19]}。在肺癌相关的研究中，let-7b-5p被明确指出在肺类癌（一种神经内分泌肿瘤）中表达下调^[11]。而let-7b-5p在NSCLC组织中高表达还是低表达存在争议^[12-13]。此前研究报道显示，血清中检测到let-7b-5p高表达的NSCLC患者具有更好的预后，但在NSCLC患者和健康人的血清样本中未发现let-7b-5存在表达差异^[20]。本研究纳入的数据集中，并非所有数据集都可检测到NSCLC组和对照组的let-7b-5表达有差异。这提示上述未发现NSCLC体液中let-7b-5p的低表达的研究可能是由于相关研究仅基于单中心数据所致^[20]。为明确健康人和NSCLC患者血液中的let-7b-5p表达水平差异，本研究纳入多中心数据进行研究。考虑到不同NSCLC亚型之间let-7b-5p的表达状态可能存在差异，本研究在LUAD和LUSC患者中分别分析let-7b-5p的表达水平。结果显示，与健康人比较，LUAD患者和LUSC患者的血液中均检测到更低水平的let-7b-5p；LUAD及LUSC亚型的meta分析也支持NSCLC中let-7b-5p低表达的结论。

let-7b-5p在血液中的表达水平具有诊断NSCLC患者的潜力。成功的早期诊断可提升肺癌患者的预后^[21]。本研究显示，血液中的let-7b-5p表达水平可以将LUAD患者和LUSC患者从健康人群中区分出来，表明该分子用于筛选NSCLC患者的可行性。事实上，此前已有研究揭示可通过检测血浆中的let-7b-5p筛检鼻咽癌患者（AUC=0.676）^[22]。let-7b-5p的潜在靶基因可能也具有诊断NSCLC的效能。通过综合数据库预测以及UGs筛选等方法进行分析，BZW2、CDC25A、CDCA8、COL3A1、ESPL1、HMGA1、IGF2BP3、NME4、PGM2L1及RRM2被鉴定为let-7b-5p在NSCLC中的潜在靶基因。虽然未能采集血液样本直接检测这10个潜在靶基因诊断NSCLC的效能，但这些分子的组织表达水平可以区分NSCLC组织和正常肺组织，表明其可能同let-7b-5p具有类似地筛检NSCLC的能力，但仍需体液样本验证。同时，let-7b-5p的靶基因诊断NSCLC的可观效能一定程度上印证let-7b-5p诊断NSCLC的潜力。

综上所述，本研究首次揭示let-7b-5p在NSCLC患者的血液中低表达，并明确let-7b-5p表达水平可能可用于诊断NSCLC。let-7b-5p的10个潜在靶基因BZW2、CDC25A、CDCA8、COL3A1、ESPL1、HMGA1、IGF2BP3、NME4、PGM2L1及RRM2也具有诊断NSCLC的效能。然而，let-7b-5p在NSCLC中的分子机制及其10个潜在靶基因在NSCLC中的临床意义及潜在分子机制尚需体内外实验进一步探讨。

致谢: 感谢广西医学病理学重点实验室提供技术支持