据2018年世界癌症统计数据表明，胃肠道肿瘤相关的死亡率达近17%，而在中国更是上升至近25%^[1-2]。胃肠道肿瘤早期症状多不典型，从而较多失去早期诊断机会，多数患者在诊断胃肠道肿瘤时多处于中晚期并常失去根治性手术机会。因此，积极探寻胃肠道肿瘤早期诊断标志物及发生和发展相关机制以实施更有效的防治显得极为重要。肿瘤细胞可释放一系列的细胞因子、生长因子、黏附分子和细胞外基质蛋白，介导肿瘤微环境和肿瘤预转移龛（pre-metastatic niche）之间的细胞间交流。外泌体作为重要的细胞间通讯分子参与肿瘤微环境中细胞间的信号转导以及肿瘤发生、增殖、侵袭和迁移等过程，并在其中起着关键作用。本文现就外泌体的结构与生物学功能及其在胃肠道肿瘤诊治中的应用作一简要综述。

1 外泌体的结构与生物学功能

外泌体是一种具有双层膜结构的细胞外囊泡，直径30~150 nm。病理生理条件下几乎所有细胞均可分泌产生外泌体。其最早被发现可追溯至20世纪80年代，绵羊网织红细胞在成熟的过程中会向细胞外分泌一种囊泡状结构的，当时认为这种小囊泡具有外化转铁蛋白受体的功能，随后的研究进一步证实这种分泌小泡的存在并将其命名为外泌体。现认为外泌体形成于细胞膜内陷形成的早期胞内体（early endosome，EEs），而后早期内吞体向内出芽并选择性包裹蛋白质和核酸，形成多囊泡体（multivesicular endosome，MVE），一部分MVE会与细胞内的溶酶体结合进一步降解内容物，还有部分MVE会在胞内分子马达牵引下与细胞膜融合而释放外泌体到细胞外进一步发挥其作用^[3]。这是一个连续而复杂的过程，转运必需内体分选复合物（the endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）是参与调节MVE形成的关键因素，主要包括ESCRT 0、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ及囊泡分拣蛋白4（vacuolar protein sorting 4，Vps4）；此外也有非ESCRT依赖途径参与MVE形成的调节，如神经酰胺依赖途径和四跨膜蛋白依赖途径^[4]。外泌体释放后即可通过细胞吞饮、胞膜融合或配体受体结合等方式进入靶细胞，进而影响靶细胞内信号通路转导、相关基因表达以及生化代谢过程。外泌体广泛存在于血液、尿液、脑脊液、羊水和腹腔积液等多种体液中。但近来的研究也发现，外泌体在生物代谢动力学方面表现出体内分布的器官特异性；外泌体往往在脾脏、肾脏、肺和骨髓等部位聚积^[5]。这可能与其表面分子有关。研究显示，整合素与外泌体促进器官特异性预转移龛形成有关，但具体的机制仍待进一步研究^[6]。外泌体本身具有的膜结构具备良好的脂溶性，同时可以作为内容物的天然保护屏障防止周围酶类对运载物的分解，因而可以有效运输药物、蛋白质和核酸等物质，其与肿瘤发生和发展关系密切，且在肿瘤诊治中有着重要作用。

2 外泌体与胃肠道肿瘤的关系

外泌体可参与胃肠道肿瘤发生和发展的多个环节，包括肿瘤增殖生长、侵袭转移、脉管生成、免疫逃逸以及化疗耐药等。2009年首次报道胃癌SGC7901细胞来源的外泌体可以促进胃癌SGC7901和BGC823细胞的增殖，外泌体到达胃癌细胞后激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）与有丝分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）信号通路，从而促进胃癌细胞的增殖^[7]。胃癌细胞外泌体转运的miR-423-5p可以抑制融合蛋白抑制因子（suppressor of fused protein，SUFU）的表达，同时促进胃癌细胞的增殖^[8]。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞向间质细胞表型转变的过程，这一转变赋予细胞转移和入侵的能力。EMT的发生将有利于肿瘤细胞脱离原发灶进入循环系统继而形成转移。研究通过比较结肠癌细胞株SW480和SW620的外泌体蛋白组分发现2种细胞株本身虽具有相同的基因，但转移性更强的SW620细胞来源的外泌体含有丰度更高的EMT相关因子及信号转导分子，提示外泌体可能通过参与EMT等生理病理过程影响结肠癌细胞的转移性^[9]。肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）对肿瘤的发生和发展意义重大。研究发现，肿瘤相关成纤维细胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAFs）来源外泌体可以促进结直肠癌（colorectal cancer，CRC）细胞向CSCs转变，从而促进肿瘤加速生长^[10]。

新生血管的形成是肿瘤的生长和转移的重要环节。肿瘤细胞来源外泌体可通过多种途径促进肿瘤新生血管形成，促使肿瘤进展。胃癌细胞外泌体携带的miR-130 a通过靶向激活血管内皮细胞原癌基因C-MYB促进胃癌血管生成^[11]。CRC患者外泌体通过传递miR-25-3p靶向作用于内皮细胞内的Krüppel样转录因子2（Krüppel-like factor 2，KLF2）和KLF4，进而影响下游靶基因血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）、occludin以及ZO-1等紧密连接相关蛋白（tight junction related proteins）基因的转录活性，从而提高血管通透性和促进肿瘤血管生成^[12]。此外，肿瘤诱导的血管通透性增加和血管生成也是预转移龛形成的一个重要特征，而预转移龛的形成又和肿瘤的远处转移密切联系。

肿瘤微环境的改变是肿瘤发展过程中的重要环节，微环境的免疫抑制状态有利于肿瘤的发展和转移。现已公认肿瘤细胞可以通过“教育”免疫细胞调节肿瘤微环境从而建立稳定的免疫抑制微环境促进肿瘤进展，而肿瘤细胞来源外泌体在“教育”过程中发挥的免疫活性作用成为近来研究的热点。巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分。目前认为静息巨噬细胞在不同影响因素作用下可极化为具有炎性反应促进作用的经典活化型（classically activated macrophages，M1型）和具有炎性反应抑制作用的替代活化型（alternatively activated macrophages，M2）两类。现多认为前者在肿瘤杀伤效应中发挥积极作用而后者则可促进肿瘤的浸润和转移。胃癌细胞SGC7901和BGC823来源的外泌体可以“教育”单核细胞成为程序性死亡蛋白-1（programmed cell death-1，PD-1）阳性的肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）。该巨噬细胞具有M2表型，可分泌白介素-10（interleukin-10，IL-10）抑制CD8⁺T细胞的细胞毒作用^[13]。p53基因突变的肠癌细胞来源外泌体可以介导微环境中巨噬细胞表型转变，从而有利于肿瘤的生长和转移^[14]。此外，胃癌细胞来源外泌体还可以通过传递高迁移率组盒1（high mobility group box-1，HMGB1）与接收细胞Toll样受体-4（Toll-like receptor-4，TLR-4）结合，进而激活NF-κB信号通路，促使中性粒细胞极化为N2表型，而N2表型中性粒细胞表现为促肿瘤生长和免疫抑制活性^[15]。肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）是肿瘤微环境中的重要组成部分，在塑造肿瘤微环境免疫抑制特性中发挥促进作用并与患者不良预后相关。研究显示，来源于胃癌细胞的外泌体携带mir-27a调节成纤维细胞向CAFs转化，后者则促进胃癌细胞的多种恶性生物学行为^[16]。结直肠癌来源外泌体携带miR-10b通过PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）途径调节基质成纤维细胞获得CAFs表型，可能是促进肿瘤进展的一个因素^[17]。调节性T细胞（regulatory T cell，T_reg）是一类CD4+CD25+的免疫抑制性T细胞，T_reg在肿瘤部位富集可以增强肿瘤免疫耐受。CRC细胞外泌体携带TGF-β1，可以激活TGF-β/Smad通路和抑制应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）通路，使T细胞向T_reg细胞样转变，促进肿瘤生长^[18]。

肿瘤细胞耐药是限制化疗效果和影响患者预后的一个重要原因。外泌体可以介导耐药细胞和敏感细胞之间以及肿瘤细胞和基质细胞之间耐药性的传递。研究发现，在CRC患者CAFs来源外泌体可以以旁分泌方式传递Wnt到周围肿瘤细胞，从而激活Wnt/β-catenin信号通路，刺激分化型CRC细胞产生CSCs表型并获得化疗耐药性^[19]。外泌体可以直接传递巨噬细胞中miR-21到胃癌细胞，从而赋予胃癌细胞顺铂抗性，增强胃癌细胞耐药性^[20]。研究报道，耐药胃癌细胞株来源的外泌体可以通过传递miR-155-5p直接结合敏感细胞胞内相应作用靶点的3‘非翻译区（3' untranslated regions，3'UTR），介导药物敏感细胞的产生EMT表型和耐药性^[21]。此外，外泌体可以促进接收细胞通过排出药物来起到化疗耐药的作用。有相关研究表明，MSCs可以通过转移蛋白质（MRP2、ATP7A和ATP7B）和miRNAs（miR-100、miR-222、miR-30a和miR-17）来介导接收细胞的耐药特性^[22]。

3 外泌体在胃肠道肿瘤诊断中的作用

对外泌体研究的不断深入探索发现，其可成为胃肠道肿瘤诊断领域一种相对创伤小、敏感度高且更加经济的检测手段，这主要归结于外泌体具有如下的特点：（1）肿瘤患者外泌体成分和（或）释放量的改变提示外泌体具备应用于肿瘤诊断的价值；（2）外泌体的双层膜结构可以保护蛋白质和核酸等活性物质不被外界的各种酶所消化，保持内容物的稳定（研究表明，在4℃条件下存放96 h或在-70℃条件下长期存放对miRNA的含量没有显著的改变^[23]）；（3）外泌体广泛存在于各种体液，获取样本相对简单；（4）相较凋亡小体和微囊泡而言，外泌体携带的特异性分子标志物含量更高，因而有利于临床检测的应用^[24]。这些理想的特点保障外泌体作为一种新的生物标志物应用于早期发现肿瘤，利于推动癌症个体化治疗发展。

3.1 外泌体用于肿瘤早期诊断

现对于外泌体在胃肠道肿瘤领域的应用研究主要集中在早期诊断方面。在胃肠道肿瘤患者中，早期诊断已经成为影响预后的重要因素并且决定后续的治疗方案。外泌体在肿瘤患者体液中的释放量较健康人而言有明显的提升，其内在组成与健康人比较也有差异，并且这种差异主要体现在miRNA成分方面。Kahroba等^[25]列出可能作为肿瘤诊断标志物的30种miRNA，外泌体来源涵盖外周血、血浆、血清和腹腔灌洗液（peritoneal lavage fluid，PLF）等多种体液以及细胞株培养液。研究发现，胃癌患者血清外泌体中miR-19b-3p及miR-106a-5p表达水平高于健康人^[26]。从20例结肠癌患者血清中提取外泌体，对其RNA进行分析显示，结肠癌患者血清外泌体中miR-21水平高于健康对照组，提示血清miR-21可用于结肠癌的早期诊断^[27]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一种与肿瘤的发生和发展密切相关的非编码RNA。研究表明，结直肠肿瘤差异表达基因（colorectal neoplasia differentially expressed，CRNDE）、结肠癌相关转录本基因（colon cancer associated transcript，CCAT）和H19等基因编码lncRNA可用于早期CRC诊断并具有高准确性^[28]。外泌体中的lncRNA一样具有作为诊断标志物的潜力^[25]。有研究比较胃癌患者（n=126）和健康人（n=120）血浆样本来源外泌体中的lncRNA（HOTTIP）水平发现，其在胃癌患者中表达水平上升，且与浸润深度和TNM分期有关；接受者操作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析提示，HOTTIP作为诊断标志物的作用优于癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原199（carbohydrate antigen 199，CA199）和CA72-4^[29]。研究显示，与健康组（n=50）比较，CRC患者（n=50）血清来源外泌体中有LNCV6_116109、LNCV6_98390、LNCV6_38772、LNCV_108266、LNCV6_84003和LNCV6_98602 6种lncRNA含量上调^[30]。ROC曲线分析结果表明，曲线下面积最低值为0.650（LNCV6_38772），最高值为0.770（LNCV6_116109）。胃动蛋白-1（gastrokine1，GKN1）是一种由胃上皮细胞分泌的蛋白质，体内和体外实验均表明，其可以抑制胃癌细胞增殖及诱导胃癌细胞凋亡。比较GKN1在健康受试者、胃癌患者、肝癌患者及CRC患者血清中的水平发现，胃癌患者血清中GKN1的浓度低于其他三组，提示GKN1可望在胃癌早期诊断和临床治疗中发挥作用^[31]。

3.2 外泌体用于肿瘤转移复发评估

肿瘤的转移复发是影响患者预后的另一重要因素。外泌体可望在预估肿瘤预后和转移复发风险中发挥积极作用。伴有浆膜侵袭的胃癌常常预后不良，其中最主要的原因是其常伴发腹膜转移。而腹膜转移的难以预测和诊断也令其成为临床上最复杂和常见的复发转移形式。传统上使用PLF细胞学检查来预测腹膜转移风险，但是其敏感度较低。恶性腹腔积液虽然是腹膜转移患者最常见的症状，但是临床上也有患者不产生恶性腹腔积液。因而发展更加有效的检查手段实现胃癌腹膜转移风险的预测和早期诊断对患者的预后改善具有积极意义。通过PLF提取外泌体并分析其中miRNA表达谱的改变有望实现对胃癌腹膜转移的早期诊断。有研究指出，当胃癌患者处于T4期时PLF中miR-21和miR-1225-5p的含量相较T1~3期上调，提示miR-21和miR-1225-5p可能与肿瘤“预转移龛”的形成有关并可作为预测胃癌腹膜转移的生物标志物^[32]。研究发现，外泌体miR-25-3p的传递可以促进肿瘤“预转移龛”的形成，其在循环外周血中的水平升高也可以作为预测CRC转移的预测因子^[12]。通过对232例胃癌患者和20名健康人血浆外泌体中miR-23b水平的比较发现，miR-23b胃癌的复发密切相关，提示其可作为胃癌复发的风险预测因子^[33]。CA125富集外泌体的研究提示转移性结肠癌的可能^[34]。

4 外泌体在胃肠道肿瘤治疗中的作用

随着外泌体在肿瘤发生和发展中的作用不断被阐明，将其应用于肿瘤治疗中的研究也随之较为广泛展开。外泌体在胃肠道肿瘤发生及进展中主要发挥信息传递作用，阻断该传递作用可能有助于肿瘤的治疗。Gobbo等^[35]研究报道，肿瘤来源外泌体外膜锚着的HSP70可以通过与髓系来源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）表面的TLR2（Toll like receptor 2）结合激活MDSCs，促进肿瘤微环境免疫抑制状态，而利用多肽适配体A8结合HSP70膜外结构域可以阻断HSP70和TLR2的交互作用，从而解除由此介导的免疫抑制效果。质子泵抑制剂（proton pump inhibitors，PPIs）传统用于抑制胃酸分泌，但也研究表明其在胃癌治疗中同样可以发挥积极作用。PPIs可以抑制胃癌细胞外泌体的释放，从而降低胃癌细胞的恶性程度，抑制CAFs形成，改善肿瘤微环境^[36]。

近年来关于外泌体用于肿瘤治疗的相关研究更多聚焦于其作为载体实现有效载荷的靶向运输。一方面传统化疗药物如紫杉醇、奥沙利铂和顺铂等都无法靶向针对肿瘤细胞，从而带来较多不良反应，甚至可导致患者无法耐受，影响化疗治疗效果；另一方面，外泌体表面有着复杂的蛋白质及糖蛋白网络，这些网络可在外泌体靶向特定细胞摄取方面起到重要作用；同时结合外泌体的双层膜结构及其来源于机体本身的特点，令其有望成为一种具有低免疫原性、高生物相容性和高效率的药物载体。因此，以外泌体为药物或基因载体的研究有望开辟肿瘤靶向治疗新途径。通过外泌体装载药物还可以提高疏水性药物的抗肿瘤效用。已有研究表明，外泌体装载阿司匹林可以有效提高药物溶解能力和药物的细胞毒性^[37]。外泌体装载紫杉醇对多药耐药细胞MDCKMDR1的细胞毒性提升将近50倍^[38]。小鼠模型实验发现，通过外泌体的载体作用传递anti-miR-214到胃癌细胞，可以逆转高水平miR-214相关的顺铂耐药，并能抑制肿瘤的体内生长^[39]。外泌体可以介导miR-29a和miR-29c靶向结合VEGF mRNA的3‘非翻译区，从而能下调VEGF在胃癌细胞的表达，抑制胃癌组织血管生成^[40]。此外，利用外泌体运载HGF-siRNA可以抑制SGC-7901细胞的增殖和迁移，并在小鼠模型中观察到肿瘤生长抑制和血管生长抑制作用^[41]。通过外泌体运载抗肿瘤蛋白也能产生抗肿瘤效应，健康人相对于胃癌患者的组织和血浆来源外泌体中含有更高水平的tripartite motif-containing protein 3（TRIM-3）蛋白，提示TRIM-3蛋白可能具有肿瘤抑制作用，外泌体运载TRIM-3蛋白在体内外都展现出抗肿瘤效果^[42]。外泌体携带的GKN1蛋白具有抑制GC细胞增殖和促进GC细胞凋亡的作用^[31]。有研究通过构建抗体功能化外泌体（antibody-functionalized exosomes）提高外泌体靶向性，搭载多柔比星实现多柔比星靶向针对结直肠癌细胞的抗肿瘤作用^[43]。

此外，外泌体在诱导激活抗肿瘤免疫方面的作用也日益引起研究者的关注。研究发现，热应激肿瘤细胞外泌体（exosomes derived from heat-stressed tumour cells，HS-TEXs）含有更丰富的热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70），与普通外泌体比较，有更强的刺激树突状细胞产生IL-6的作用，肿瘤微环境中IL-6水平升高有助于T_reg转变为Th17，因而可以产生更强的抗肿瘤免疫^[44]。对外泌体进行工程化改造可以同时向抗原呈递细胞（antigen-presenting cell，APC）传递抗原和佐剂，从而驱动人体针对肿瘤抗原的固有、细胞和抗体介导的免疫反应，达到肿瘤治疗的目的。

5 结语

胃肠道肿瘤细胞来源的外泌体可在细胞之间传递miRNA、lncRNA和蛋白质等生物活性物质，在胃肠道肿瘤的发生和发展中扮演着极其重要角色，愈益受到学者们的关注。外泌体在体液中的广泛分布、膜结构带来的稳定性和大分子内容物表达谱的差异让其在胃肠道肿瘤的早期诊断和预后判断等方面都具有良好应用前景，以其为基础的液体活检可望成为未来肿瘤诊断的重要手段。在胃肠道肿瘤治疗方面，外泌体可作为抗肿瘤药物靶向载体、肿瘤防治靶点、诱导抗肿瘤免疫以及为临床化疗耐药及不能耐受化疗的患者创造新的治疗策略。综上所述，外泌体在胃肠肿瘤诊治中的应用潜在着广阔的前景，值得进一步深入探索，必将更好造福胃肠道肿瘤患者。