2022, Vol. 37文章信息
- 李丹秀, 何阳菘, 程浩, 庞茂桂, 叶小妮, 安广洲, 周云, 卢瑗瑗, 赵晓迪, 王新
- Li Danxiu, He Yangsong, Cheng Hao, Pang Maogui, Ye Xiaoni, An Guangzhou, Zhou Yun, Lu Yuanyuan, Zhao Xiaodi, Wang Xin
- eRNA AP003469.2与肝细胞癌患者预后的相关性分析
- Correlation analysis of eRNA AP003469.2 and prognosis of patients with hepatocellular carcinoma
- 实用肿瘤杂志, 2022, 37(2): 128-137
- Journal of Practical Oncology, 2022, 37(2): 128-137
基金项目
- 国家自然科学基金面上项目(82173256，82073197，81972224，81871913);国家优秀青年科学基金项目(81822031)
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通信作者
- 王新，E-mail：wangx@fmmu.edu.cn
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文章历史
- 收稿日期：2021-11-27
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2. 空军军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室，消化疾病国家临床研究中心，陕西 西安 710032
2. State Key Laboratory of Cancer Biology and National Clinical Research Center for Digestive Diseases, Xijing Hospital of Digestive Diseases, Air Force Military Medical University, Xi'an 710032, China
原发性肝癌是全球高发的消化系统恶性肿瘤之一，死亡率仅次于肺癌和结直肠癌[1]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC) 是其中最常见的病理类型，约占原发性肝癌的75%~85%[1]。目前，HCC的治疗方式主要包括手术切除、放疗、分子靶向治疗、肝移植、介入治疗和免疫治疗[2]。由于HCC起病隐匿，许多患者确诊时已是晚期，无法得到早期干预和治疗，导致总体预后不佳。目前，甲胎蛋白是HCC最常用的生物标志物，但其敏感度和特异度较低，无法满足HCC患者早期发现和病情监测的需求[3]。因此，研发更有价值的生物标志物和治疗靶点以评估HCC患者的预后和提供更优化的治疗策略迫在眉睫。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度 > 200个核苷酸的RNA分子。目前研究表明，lncRNA在肿瘤的恶性生物学行为中如细胞增殖、抵抗凋亡、细胞代谢失常、免疫逃逸、侵袭和转移等过程中发挥重要的调控作用[4]。增强子是一种与RNA聚合酶Ⅱ、转录因子和共转录分子结合的DNA调控元件，可增强靶基因转录[5]。增强子RNA(enhancer RNA，eRNA)是由增强子转录生成的一种特殊类型的lncRNA。现有模型表明，eRNA既可以直接与增强子结合激活增强子活性，也可以通过与RNA聚合酶Ⅱ和转录因子相互作用，促进启动子-增强子的结合，从而促进下游基因的转录[6]。肿瘤中表达异常的eRNA在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。例如，LINC02257作为结肠腺癌的独立预后生物标志物，可通过激活磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B，PI3K-Akt)信号通路调控细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的降解，进而促进结肠腺癌的转移[7]。AP001056.1是头颈部鳞状细胞癌组织特异性表达的eRNA，且与患者预后相关。AP001056.1通过调控免疫检查点蛋白的表达进而影响肿瘤的进程[8]。eRNA有希望成为临床实践中的预后标志物或治疗靶点。尽管eRNA在恶性肿瘤中发挥的作用得到了越来越深入的研究，但eRNA在HCC中的功能尚未完全阐明。笔者使用生物信息学分析筛选出多个与HCC预后相关的eRNA，通过数据分析发现，高AP003469.2的表达与HCC患者的不良预后相关，且与多个恶性临床特征相关，并参与调控患者的肿瘤微环境和肿瘤细胞的迁移，是HCC的潜在治疗靶点。
酪氨酸/色氨酸羟化酶激活蛋白ζ(tyrosine and tryptophan hydroxylase activators zeta，YWHAZ)属于14-3-3蛋白质家族，其通过与含磷酸丝氨酸的蛋白质结合介导信号转导。YWHAZ参与多种类型肿瘤的生物学功能，包括生长、细胞周期、细胞凋亡和迁移[9]。目前已有研究报道，YWHAZ可通过调控Rac家族小鸟苷三磷酸酶1(Rac family small guanosine triphosphatase 1，RAC1) 的活性影响细胞伪足和细胞膜皱褶形成[10]。
中性粒细胞在肿瘤中发挥的作用仍不明确。肿瘤微环境中的中性粒细胞多分为两个亚型：(1)N1型，主要发挥抗肿瘤特性; (2)N2型，可促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等特性[11]。但由于两者之间的形态区别不大且表面标志物的表达有重叠，无法彻底区分N1和N2亚型。中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs) 是中性粒细胞激活后释放到胞外的网状超微结构，由中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和DNA-组蛋白酶复合物组成[12]。NETs在防御全身感染方面发挥着至关重要的作用，同时也参与非感染性疾病，例如自身免疫性疾病和癌症。肿瘤相关中性粒细胞(tumor-associated neutrophils，TANs)可将NETs释放到肿瘤微环境中，并在肿瘤的进展中发挥着突出作用[13]。NETs可激活休眠的癌细胞、支持肿瘤细胞的免疫逃逸、增强肿瘤细胞的侵袭能力和促进肿瘤血管形成等[14]。目前，已有研究报道，在HCC中发现NETs的存在，但NETs在HCC中的作用以及潜在的机制仍需进一步研究[15]。
1 资料与方法 1.1 数据采集2021年3月16日从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov)下载HCC和其他32种癌症类型的基因表达的RNA-seq配置文件，格式为每百万千碱基片段数(fragments per kilobase per million，FPKM)和原始计数。使用人类的基因注 释文件(gene transfer format，GTF)将Ensemble ID转换为其相应的基因名称。临床表型数据也从数据库中检索下载。
1.2 与HCC预后相关eRNA和靶基因的筛选排除临床信息不完整的样本后，通过使用R语言limma软件包，将eRNA和靶基因表达矩阵与HCC患者的生存信息相结合。应用Kaplan-Meier法分析，以错误发现率(false discovery rate，FDR) 调整后的P < 0.05作为标准，筛选与生存相关的eRNA和靶基因。进行Spearman相关分析，筛选出与靶基因表达相关的关键eRNA，筛选标准为spearman r > 0.4和P < 0.05。
1.3 目的eRNA与其靶基因的临床特征分析基于选定的eRNA和靶基因，使用R语言survival软件包评估目的eRNA和靶基因与HCC患者临床特征之间的关系，包括人口统计学(年龄、性别和种族)、肿瘤信息[肿瘤组织学分级、美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)分期和TNM分期]以及生存率。
1.4 基因富集分析基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA) 是通过使用R语言cluterprofile数据包分析来自TCGA数据库的归一化RNA-Seq数据。基因本体论(Gene Ontology，GO) 和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG) 通路分析以研究eRNA潜在的生物学功能。GO分析主要分析eRNA生物过程(biological process，BP)、细胞成分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)，KEGG分析主要显示eRNA的通路富集。筛选标准均为P < 0.05。
1.5 细胞培养人肝癌细胞株Hep 3B购买于美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)。细胞培养于加有10% 胎牛血清(HyClone，美国)和1% 青霉素-链霉素(Gibco，美国)的DMEM培养液(Gibco，美国)中。并在37℃ 5% CO2条件下孵育。
1.6 寡核苷酸和小干扰RNA转染靶向AP003469.2的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)和靶向YWHAZ的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)由上海擎科生物设计和合成。使用JetPRIME转染试剂(Polyplus Transfection，美国)，按照说明书的操作步骤将ASO和siRNA及相应的对照转染到靶细胞中。序列如下：AP003469.2 ASO#1为C*A*G*A*ATCTGCATTTCT*G*A*C*A，AP003469.2 ASO#2为C*A*C*T*TGCAAATCTCTT*C*A*T*A; siYWHAZ#1为GAGCUGAAUUAUCCAAUGATT，siYWHAZ#2为CGUCUCAAGUAUUGAACAATT。
1.7 定量实时PCR使用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)从培养的细胞中提取总RNA，并使用miRNAeasy试剂盒(Qiagen，美国)对RNA进行纯化。对于mRNA检测，使用QuantiTect Reverse Transcription Kit(Qiagen，美国)反转录总RNA，并使用SYBR Premix Ex Taq(Takara，大连)通过实时PCR扩增双链cDNA。AP003469.2和YWHAZ的PCR引物以及内参引物GAPDH由上海擎科生物合成。PCR引物如下：AP003469.2上游引物为5'-TACCAAGGTTGCCCCATCTC-3'，AP003469.2下游引物为5'-TGCTGGGGCTTCTTTAGTGG-3';YWHAZ上游引物为5'-GTAGGAGCCCGTAGGTCATC -3'，YWHAZ下游引物为5'-GTGAAGCATTGGGGATCAAGA-3'; GAPDH上游引物为5'- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，GAPDH下游引物为5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。PCR分析在LightCycler 480系统(Roche，瑞士)上进行。GAPDH用作内部对照。2-ΔΔCt方法用于确定每个样品相对于参考样品的RNA相对表达水平。
1.8 体外增殖实验通过CCK-8分析确定细胞的增殖能力。将1×103个细胞接种在96孔板中，每个样本5个副孔，并在37℃ 5% CO2条件下孵育。细胞贴壁后分别在0、1、2、3、4、5和6 d后用10% CCK-8溶液(Dojindo，日本)孵育2 h，使用Varioskan® Flash光谱仪(Thermo Fisher Scientific，美国)测量450 nm处的吸光度值，并绘制生长曲线。
1.9 体外迁移和侵袭实验通过transwell实验评估细胞迁移和侵袭能力。在迁移实验中，将2×105个Hep 3B细胞接种于无基质胶涂层的上室(Millipore，美国)。在侵袭实验中，在transwell小室上室中被铺上Matrigel (BD Biosciences，美国) 1 h后，将2×105个Hep 3B细胞接种于上室。小室加入600 µL 20% 胎牛血清的DMEM培养液。在37℃ 5% CO2条件下孵育16 h后，将迁移或侵入细胞膜的细胞用0.1%结晶紫染色，并在显微镜下计数(Olympus，日本)以确定其相对数量。
1.10 泛癌分析在32种其他癌症中验证目的eRNA表达水平的预后价值。使用R语言survival数据包分析从TCGA数据库和基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)中检索到的不同类型癌症数据集中目的eRNA的mRNA表达水平，验证目的eRNA在肿瘤和正常组织中的表达水平，以及其与靶基因的相关性。
1.11 统计学分析采用R软件(版本3.5.3)进行统计学分析。通过非参数Wilcoxon秩检验评估肿瘤和正常组织之间的比较。正态分布数据和非正态分布数据分别用均数±标准差(x±s)表示，两组间比较分别采用Student's unpaired t检验和Mann-Whitney U检验。使用Spearman等级相关系数评估eRNA和靶基因的相关性。将Kaplan-Meier曲线与R语言survival数据包相结合，分析生存结果。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 筛选HCC中预后相关的eRNA和靶基因对TCGA数据库中374例HCC患者的RNA-seq基因表达数据以及临床特征(表 1)进行分析，其中患者年龄18~90岁，中位年龄61岁。应用Kaplan-Meier法分析鉴定出124个与HCC患者预后相关的eRNA(均P < 0.05)。通过Spearman相关性分析进一步鉴定出与靶基因有相关性的eRNA。结果显示，39对eRNA与靶基因表达水平呈正相关(spearman r > 0.4，P < 0.05)。其中，Kaplan-Meier生存分析显示，AP003469.2的高表达和低表达(以374例患者AP003469.2表达水平的中位数作为高低表达的分界点)HCC患者生存率比较，差异具有统计学意义(P < 0.01，图 1A)，具有较强的预后能力。AP003469.2的靶基因为YWHAZ。YWHAZ表达与AP003469.2呈正相关(r=0.64，P < 0.01;图 1B)。
| 临床特征 | 例数(%) |
| 总例数 | 374(100) |
| 年龄 | |
| ≤65岁 | 235(62.8) |
| > 65岁 | 138(36.9) |
| 未知 | 1(0.3) |
| 性别 | |
| 男性 | 253(67.6) |
| 女性 | 121(32.4) |
| 组织病理学分级 | |
| G1 | 55(14.7) |
| G2 | 178(47.6) |
| G3 | 124(33.2) |
| G4 | 12(3.2) |
| 未知 | 5(1.3) |
| AJCC分期 | |
| Ⅰ | 173(46.3) |
| Ⅱ | 87(23.3) |
| Ⅲ | 85(22.7) |
| Ⅳ | 5(1.3) |
| 未知 | 24(6.4) |
| T分期 | |
| T1 | 183(48.9) |
| T2 | 95(25.4) |
| T3 | 80(21.4) |
| T4 | 13(3.5) |
| TX | 1(0.3) |
| 未知 | 2(0.5) |
| N分期 | |
| N0 | 254(67.9) |
| N1 | 4(1.1) |
| NX | 115(30.7) |
| 未知 | 1(0.3) |
| M分期 | |
| M0 | 268(71.7) |
| M1 | 4(1.1) |
| MX | 102(27.3) |
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| 注 A：Kaplan-Meier总生存曲线显示TCGA数据库中AP003469.2的表达与HCC患者生存率的关系; B：TCGA数据库中AP003469.2表达与YWHAZ表达的相关性 图 1 AP003469.2与HCC患者预后相关且与YWHAZ的表达呈正相关 Fig.1 AP003469.2 was associated with the prognosis of HCC patients and positively correlated with the expression of YWHAZ |
对TCGA数据库中HCC的肿瘤和正常组织样本中AP003469.2和YWHAZ的表达进行数据提取。肿瘤组织374例，男性253例，女性121例; 患者年龄18~90岁，中位年龄61岁。正常组织50例，男性29例，女性21例; 年龄20~85岁，中位年龄67岁。对AP003469.2和YWHAZ表达与多种临床特征的相关性分析结果表明，AP003469.2和YWHAZ的表达与组织学分级、AJCC分期和T分期有关(图 2)。在组织学分级方面，AP003469.2和YWHAZ的高表达与患者的不良分化相关，但G4患者与其他患者间比较，差异均无统计学意义(均P > 0.05)，可能与患者例数较少有关。在AJCC分期方面AP003469.2在Ⅱ期和Ⅲ期患者中的表达高于Ⅰ期患者，YWHAZ在Ⅲ期患者中的表达也高于Ⅰ期患者(均P < 0.05)。在T分期方面，AP003469.2和YWHAZ的高表达与患者原发部位肿瘤的体积增大和向器官外浸润相关(均P < 0.05)。AP003469.2表达与患者年龄、性别、M分期和N分期无关(均P > 0.05)。
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| 注 *P < 0.05;**P < 0.01 图 2 TCGA数据库中AP003469.2与YWHAZ表达与HCC临床特征的关系 Fig.2 Relation between the clinical characteristics of HCC patients and the expressions of AP003469.2 and YWHAZ |
GO富集分析显示，在BP中，AP003469.2主要参与中性粒细胞的脱颗粒与活化以及对肌动蛋白、细胞外基质和细胞黏附的调控(图 3A)。在CC中，AP003469.2与ECM、片状伪足、黏附连接和侵袭性伪足等有关。在MF中，AP003469.2主要涉及细胞黏附、肌动蛋白结合、GTPase介导的信号转导分子和Ca2+信号通道的激活等。在KEGG信号通路中也富集到多个与肌动蛋白骨架调节、紧密连接和黏附斑等多条与细胞迁移和伪足相关的信号通路(图 3B)。多个基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)包括MMP9和Src激酶的表达与AP003469.2呈正相关(均r > 0.4，P < 0.01;表 2)。
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| 注 A：GO富集分析生物过程、细胞成分和分子功能中最主要的10项; B：KEGG通路分析种富集程度最高的30项; GTPase：鸟苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase); SH2：Src同源2(Src homology 2);FcγR：Fcγ受体(Fc gamma receptor); NOD：核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide binding oligomerization domain); IL-17：白细胞介素17(interleukin 17) 图 3 AP003469.2在HCC中的GO富集分析和KEGG通路分析 Fig.3 GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis of AP003469.2 in HCC |
| 基因名称 | r值 | 基因名称 | r值 | |
| ATP6AP2 | 0.412 | SYK | 0.410 | |
| ALDOA | 0.532 | RAB10 | 0.448 | |
| CLEC5A | 0.426 | VTCN1 | 0.459 | |
| SLC39A10 | 0.533 | ITGAV | 0.560 | |
| RELB | 0.420 | PRKCD | 0.490 | |
| IQGAP1 | 0.419 | AMPD3 | 0.525 | |
| RHOF | 0.432 | ARPC2 | 0.467 | |
| ABR | 0.421 | PSMA1 | 0.408 | |
| GRN | 0.404 | ALOX5 | 0.481 | |
| CDC42 | 0.423 | ACTR3 | 0.414 | |
| PSMD1 | 0.422 | TMC6 | 0.418 | |
| LIMK1 | 0.586 | ADGRE5 | 0.505 | |
| ARPC1B | 0.549 | PYCARD | 0.456 | |
| ITGAM | 0.499 | MAPK3 | 0.412 | |
| MUC12 | 0.453 | PAG1 | 0.486 | |
| CD47 | 0.402 | WASF2 | 0.443 | |
| RIPK2 | 0.458 | HPSE | 0.406 | |
| FCGR2A | 0.406 | CAPN1 | 0.407 | |
| MUC1 | 0.443 | NBEAL2 | 0.441 | |
| PSMD11 | 0.422 | PAFAH1B2 | 0.432 | |
| PKM | 0.550 | PAK1 | 0.434 | |
| CD177 | 0.438 | DBNL | 0.420 | |
| ATG7 | 0.417 | RAC1 | 0.423 | |
| FTH1 | 0.410 | CXCL1 | 0.402 | |
| SRC | 0.466 | LPCAT1 | 0.567 | |
| DEGS1 | 0.433 | IMPDH1 | 0.540 | |
| GYG1 | 0.451 | RBCK1 | 0.407 | |
| RAP2B | 0.461 | ALDH3B1 | 0.463 | |
| ZC3H12A | 0.429 | MUC13 | 0.403 | |
| PLAUR | 0.444 | CBFB | 0.434 | |
| CD58 | 0.525 | CANT1 | 0.437 | |
| CKAP4 | 0.410 | RUNX1 | 0.425 | |
| CACNB3 | 0.445 | S100A11 | 0.487 | |
| GPR84 | 0.469 | DNAJC5 | 0.434 | |
| EZR | 0.435 | DYNC1LI1 | 0.483 | |
| S100P | 0.407 | MVP | 0.492 | |
| PYGB | 0.480 | NCKAP1 | 0.418 | |
| ANXA2 | 0.578 | TRPM2 | 0.474 | |
| TNFAIP6 | 0.404 | FAF2 | 0.413 | |
| WIPF3 | 0.475 | CARD9 | 0.403 | |
| LYN | 0.456 | TNFRSF21 | 0.513 | |
| PSMD14 | 0.504 | MMP9 | 0.427 | |
| LAT2 | 0.406 | STK11IP | 0.473 | |
| DYNC1H1 | 0.534 | |||
| 注 所有基因均P < 0.01 | ||||
在肝癌细胞株Hep 3B中，进一步验证AP003469.2和YWHAZ的互作关系。通过ASO成功构建AP003469.2敲低的细胞模型后发现，AP003469.2可影响YWHAZ的mRNA表达，验证AP003469.2作为eRNA可促进YWHAZ的转录过程(图 4A)。为了验证AP003469.2和YWHAZ对HCC细胞增殖和迁移功能的影响，本研究同时构建了YWHAZ的低表达模型(图 4B)。AP003469.2和YWHAZ均可促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭功能(图 4C~4E)。
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| 注 A：AP003469.2功能缺失模型构建及其对YWHAZ mRNA表达的影响; B：YWHAZ功能缺失模型构建; C：AP003469.2和YWHAZ敲低对细胞增殖的影响; D：AP003469.2敲低对细胞迁移和侵袭能力的影响; E：YWHAZ敲低对细胞迁移和侵袭能力的影响; *与对应的ASO-NC或siNC比较，P < 0.05;**与对应的ASO-NC或siNC比较，P < 0.01 图 4 肝癌细胞株Hep 3B中AP003469.2和靶基因YWHAZ的互作关系及功能验证 Fig.4 Interaction between AP003469.2 and the target gene YWHAZ and the functional verification in HCC cell line Hep 3B |
为在其他类型的肿瘤中验证AP003469.2的预后潜力以及和YWHAZ表达的相关性，使用Kaplan-Meier法和对数秩检验对TCGA数据库中32种其他类型癌症数据进行泛癌分析。结果表明，除HCC外，AP003469.2在食管癌(esophageal carcinoma，ESCA)、多形成性胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)、肾透明细胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)、肾乳头状细胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP)和子宫内膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC)中均具有预后意义(均r > 0.4，P < 0.05;图 5)，与患者的不良预后相关。进一步分析其他癌种中AP003469.2与YWHAZ在不同类型癌症中的相关性发现，AP003469.2与YWHAZ在其他7个癌种中均有相关性(均r > 0.4，P < 0.01;图 6)。
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| 注 A：AP003469.2在食管癌中的生存曲线; B：AP003469.2在多形成性胶质细胞瘤中的生存曲线; C：AP003469.2在肾透明细胞癌中的生存曲线; D：AP003469.2在肾乳头状细胞癌中的生存曲线; E：AP003469.2在子宫内膜癌中的生存曲线 图 5 AP003469.2在泛癌中的生存曲线 Fig.5 Survival curves for AP003469.2 in pan-cancer |
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| 注 A：AP003469.2和YWHAZ在膀胱尿路上皮癌的相关性分析; B：AP003469.2和YWHAZ在乳腺浸润癌的相关性分析; C：AP003469.2和YWHAZ在肺腺癌的相关性分析; D：AP003469.2和YWHAZ在肾嫌色细胞癌的相关性分析; E：AP003469.2和YWHAZ在前列腺癌的相关性分析; F：AP003469.2和YWHAZ在直肠腺癌的相关性分析; G：AP003469.2和YWHAZ在葡萄膜黑色素瘤的相关性分析 图 6 AP003469.2和YWHAZ在泛癌中的相关性分析 Fig.6 The correlation of AP003469.2 and YWHAZ in pan-cancer analysis |
近年研究表明，lncRNA通过与染色质、RNA和蛋白质相互作用，参与基因转录调控、RNA编辑以及蛋白翻译调控等，在肿瘤的发生和发展过程中发挥着重要的调控作用[16-17]。eRNA作为lncRNA的一个特殊亚类，可以在转录水平调控相应基因的表达，从而参与多种癌症的发生和发展。eRNA参与肿瘤的生物学行为，有潜能发展为新的肿瘤预后标志物和治疗靶点。
本研究基于TCGA数据库鉴定124个在HCC中具有预后价值的eRNA。其中，AP003469.2和靶基因YWHAZ均与患者的预后密切相关。高AP003469.2和YWHAZ表达与患者的不良临床特征相关，其中包括组织病理学分级、AJCC分期和T分期等方面。在泛癌分析中，AP003469.2在ESCA、GBM、KIRC、KIRP和UCEC中与患者的不良预后均相关，说明AP003469.2可能在肿瘤中扮演癌基因的角色。目前，AP003469.2是功能尚无注 释的lncRNA，为了深入探讨AP003469.2在肿瘤的恶性生物学行为中发挥的作用，本研究对AP003469. 2进行了GO富集分析和KEGG通路分析。结果显示，AP003469.2的高表达与参与和调控中性粒细胞脱颗粒、中性粒细胞活化、细胞外基质降解、细胞骨架蛋白重构、细胞伪足和细胞黏附等细胞生物学行为的分子和通路相关。有研究报道，在HCC细胞株SMMC-7721细胞中有效敲低AP003469.2后，靶基因YWHAZ的表达无明显改变[18]，但本研究在Hep 3B细胞中敲低AP003469.2后，YWHAZ的mRNA表达水平上调，两者之间的关系还需进一步探讨。
根据上述信息，本研究进一步分析AP003469.2与NETs之间的关系。基因分析中富集到8个与AP003469.2表达相关的Ca2+信号通道的激活相关分子，Ca2+信号是NETs形成过程的重要组成部分，且Ca2+的内流与肿瘤的发生和发展相关[19]。同时NETs通过降解ECM，释放出免疫调节细胞因子和生长因子影响肿瘤微环境，而肿瘤细胞免疫逃逸取决于肿瘤微环境中免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用。已有研究报道，蛋白水解酶能够调节主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子的细胞表面呈递，其中中性粒细胞脱颗粒过程中释放的MMP9可介导肿瘤细胞表明MHC1抗原的水解，导致肿瘤细胞免疫逃逸[20]。同时，MMP和中性粒细胞可以通过ECM的降解调节免疫和炎症反应[20]。这些结果提示，AP003469.2可能参与调控HCC中NETs的形成，并通过NETs相关的肿瘤细胞免疫逃逸作用导致肿瘤增殖和浸润。
细胞迁移和侵袭取决于基于肌动蛋白丝结构的动态形成和分解。Rho GTPase在其中发挥重要作用，可调节片状伪足、丝状伪足和侵袭伪足等以及细胞-细胞和细胞-细胞外基质黏附等过程[21]。以整合素为核心的细胞-ECM黏附在细胞信号传导中发挥重要作用，黏着斑是研究最广泛的细胞整合素黏附复合物，在细胞前缘的片状伪足上形成，通过调节伪足与基质的黏附以及肌动蛋白的流动调节细胞的运动[22]。KEGG通路分析和GO富集分析也发现了肌动蛋白丝重塑相关的基因以及与黏着斑、细胞-基质连接、片状伪足和侵袭性伪足相关的细胞成分。AP003469.2也可能通过Rho家族GTPase活性，调节细胞骨架重塑以及细胞-细胞和细胞-细胞外基质黏附等过程促进HCC细胞的迁移和侵袭。
本研究模型是基于TCGA数据库的生物信息学分析，并在细胞生物学层面初步探索了AP003469.2对HCC恶性生物学行为的调控作用。本研究的局限性在于未能在动物和患者组织水平验证该模型。
总之，本研究通过生物信息学分析来筛选一系列与HCC患者预后相关的eRNA和靶基因。其中eRNA AP003469.2是与HCC患者不良预后相关的分子。通过分析，AP003469.2可能成为对HCC早期诊断和预后预测的潜在标志物，并可能成为HCC患者精准治疗的一个有前景的免疫相关治疗靶点。
| [1] |
Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2021, 71(3): 209-249. DOI:10.3322/caac.21660 |
| [2] |
都亚薇. 肝癌免疫治疗的研究现状及展望[J]. 实用肿瘤杂志, 2021, 36(5): 393-398. |
| [3] |
Okuda K. Hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol, 2000, 32(1_Suppl): 225-237. |
| [4] |
Liu SJ, Dang HX, Lim DA, et al. Long noncoding RNAs in cancer metastasis[J]. Nat Rev Cancer, 2021, 21(7): 446-460. |
| [5] |
Studniarek C, Egloff S, Murphy S. Noncoding RNAs set the stage for RNA polymerase Ⅱ transcription[J]. Trends Genet, 2021, 37(3): 279-291. DOI:10.1016/j.tig.2020.09.013 |
| [6] |
Adhikary S, Roy S, Chacon J, et al. Implications of enhancer transcription and eRNAs in cancer[J]. Cancer Res, 2021, 81(16): 4174-4182. DOI:10.1158/0008-5472.CAN-20-4010 |
| [7] |
Xiao JB, Liu YJ, Yi J, et al. LINC02257, an enhancer RNA of prognostic value in colon adenocarcinoma, correlates with multi-omics immunotherapy-related analysis in 33 cancers[J]. Front Mol Biosci, 2021, 8: 646786. DOI:10.3389/fmolb.2021.646786 |
| [8] |
Gu XL, Wang LX, Boldrup L, et al. AP001056.1, A prognosis-related enhancer RNA in squamous cell car-cinoma of the head and nec[J]. Cancers (Basel), 2019, 11(3): E347. DOI:10.3390/cancers11030347 |
| [9] |
Mei J, Liu Y, Yu XQ, et al. YWHAZ interacts with DAAM1 to promote cell migration in breast cancer[J]. Cell Death Discov, 2021, 7(1): 221. DOI:10.1038/s41420-021-00609-7 |
| [10] |
Hu SL, Zhu L, Song YM, et al. Radiation-induced abscopal reproductive effect is driven by TNF-α/p38 MAPK/Rac1 axis in Sertoli cells[J]. Theranostics, 2021, 11(12): 5742-5758. DOI:10.7150/thno.56853 |
| [11] |
Burn GL, Foti A, Marsman G, et al. The Neutrophil[J]. Immunity, 2021, 54(7): 1377-1391. DOI:10.1016/j.immuni.2021.06.006 |
| [12] |
Honda M, Kubes P. Neutrophils and neutrophil extracellular traps in the liver and gastrointestinal system[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2018, 15(4): 206-221. |
| [13] |
Masucci MT, Minopoli M, del Vecchio S, et al. The emerging role of neutrophil extracellular traps (NETs) in tumor progression and metastasis[J]. Front Immunol, 2020, 11: 1749. DOI:10.3389/fimmu.2020.01749 |
| [14] |
Ronchetti L, Boubaker NS, Barba M, et al. Neutrophil extracellular traps in cancer: not only catching mi-crobes[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2021, 40(1): 231. DOI:10.1186/s13046-021-02036-z |
| [15] |
Tohme S, Yazdani HO, Al-Khafaji AB, et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and progression of liver metastases after surgical stress[J]. Cancer Res, 2016, 76(6): 1367-1380. DOI:10.1158/0008-5472.CAN-15-1591 |
| [16] |
Statello L, Guo CJ, Chen LL, et al. Gene regulation by long non-coding RNAs and its biological functions[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2021, 22(2): 96-118. |
| [17] |
宋文渊, 武金才, 吴雷, 等. 血清lncRNA-PVT1在肝细胞癌诊断及预后中的意义[J]. 实用肿瘤杂志, 2020, 35(4): 317-321. |
| [18] |
白易, 吴昊, 张雅敏. 肝细胞癌患者预后相关增强子RNA和对应靶基因的筛选及其预后预测意义[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2021, 28(9): 914-919. |
| [19] |
Surolia R, Li FJ, Wang Z, et al. NETosis in the pathogenesis of acute lung injury following cutaneous chemical burns[J]. JCI Insight, 2021, 6(10): 147564. |
| [20] |
Albrengues J, Shields MA, Ng D, et al. Neutrophil extracellular traps produced during inflammation awaken dormant cancer cells in mice[J]. Science, 2018, 361(6409): eaao4227. |
| [21] |
Lawson CD, Ridley AJ. Rho GTPase signaling complexes in cell migration and invasion[J]. J Cell Biol, 2018, 217(2): 447-457. |
| [22] |
Mishra YG, Manavathi B. Focal adhesion dynamics in cellular function and disease[J]. Cell Signal, 2021, 85: 110046. |