目前，前列腺癌（prostate cancer，PCa）在我国是常见的男性恶性肿瘤之一，虽然发病率较西方发达国家低，但是，随着近年来生活环境的改变，发病率呈上升趋势，已位居泌尿系肿瘤首位，且增长率较欧美国家更为迅速^[1-2]。前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）的测定是诊断PCa最敏感的指标之一，因为PSA是一种存在于前列腺腺泡、腺上皮或精液中的糖蛋白。然而，PSA仅仅是对前列腺组织特异，而不是对PCa组织特异，并不是所有PCa患者血清PSA均升高，即使血清PSA升高也不能仅仅考虑PCa，如前列腺炎（prostatitis，Ps）、良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）、急性尿潴留以及相关前列腺检查(直肠指征和尿道膀胱镜检查等)均可引起血清PSA升高。已有大量研究表明，PCa根治术后标本中zeste增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）蛋白异常高表达，并与肿瘤分级呈正相关，与临床预后呈负相关^[3-4]。临床上多数PCa为腺癌，表面的前列腺的腺上皮是PCa的形成区域，因为肿瘤细胞快速代谢的性质，从而前列腺液（expressed prostatic secretion，EPS）会存在大量的脱落肿瘤细胞^[5]。本研究检测EZH2在PCa患者的EPS中的表达，并探索其在PCa中的临床诊断价值。

1 资料与方法 1.1 研究对象

病例来源于苏州市第九人民医院泌尿外科2017年12月至2019年12月期间门诊及住院收治的前列腺疾病患者。其中，PCa 35例为PCa组，年龄59~81岁，（67.94±5.514）岁；BPH 33例为BPH组，年龄50~78岁，（66.85±5.71）岁；Ps 32例为Ps组，年龄50~73岁，（65.56±4.63）岁。招募苏州市第九人民医院泌尿外科2019年6月至2019年12月期间门诊的健康志愿者20名作为对照组，年龄50~67岁，（61.95±4.77）岁。所有PCa患者均经病理活检确认，穿刺指征依据2019中华医学会泌尿外科学分会前列腺诊治指南的规定执行^[6]，患者在进行穿刺前，通过超声经直肠按摩收集EPS。PSA正常患者通过常规方法收集EPS，并将收集到的EPS立即置于-80℃液氮罐内保存。Ps患者入组标准是EPS常规检查白细胞每高倍视野 > 10个和卵磷脂小体减少^[7]，对于PSA异常的Ps患者，经2周抗感染治疗后复查PSA，PSA明显下降。BPH组入组标准是以下尿路症状为主诉就诊的患者，通过前列腺电切术后病理确诊BPH；对于PSA异常和有穿刺指征的患者，予前列腺穿刺活检，病理确诊BPH可纳入该组。排除标准：（1）此前接受任何其他治疗；（2）患有其他肿瘤；（3）精神疾病。受试者均知情同意且获得本院伦理委员会批准。

1.2 酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

经直肠前列腺按摩提取4组研究对象的EPS，-80℃罐保存。EZH2 ELISA试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，检测EPS中EZH2水平。EPS样本1∶6稀释后加样，用酶标仪在450 nm下测得各孔吸光度（absorbance，A）值，并通过标准曲线计算EZH2含量。

1.3 RT-PCR

经直肠前列腺按摩提取4组研究对象的EPS。将EPS进行离心，去上清，分别加入RNAiso Reagent和氯仿，再次离心后取出上层水置于另一EP管中，而后与异丙醇涡旋混合后冰上静置，待RNA沉淀后再次离心，去上清后，沉淀风干，最后加入焦碳酸二乙酯水（diethyl pyrocarbonate，DEPC）溶解RNA沉淀。RNA反转录试剂盒采购自江苏凯基生物技术股份有限公司，利用RT-PCR方法，以GAPDH为内参照, 同时在一个反应体系中加入EZH2和GAPDH引物, 在一致的条件下扩增。EZH2上游引物：5'-TGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3'；下游引物：5'-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC-3'。GAPDH上游引物：5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游引物：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。通过Quantity One软件测定EZH2和GAPDH mRNA灰度值，从而计算EZH2 mRNA相对表达量（EZH2 mRNA灰度值/GAPDH mRNA灰度值）。

1.4 PSA检测

PSA检测主要是通过抽取受试者静脉血来进行，主要包含总PSA（total PSA，tPSA）和游离PSA（free PSA，fPSA）。游离PSA/总PSA比值（fPSA%）的计算公式是：fPSA%=fPSA/tPSA×100%。

1.5 统计学分析

应用GraphPad Prism 5.0软件对数据进行分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，用t检验方式检验样本均数，且均经过正态性验证，若不符合正态性分布，则采用秩和检验进行验证。多组间比较采用单因素方差分析。绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，并计算ROC曲线下的面积（area under the curve，AUC）分析EPS中EZH2在PCa临床诊断中的价值。分类变量资料采用秩性相关性分析。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 基本临床资料

4组EPS样本中均能检测到EZH2。与PCa组比较，Ps组、BPH组和对照组tPSA和fPSA%指标差异均具有统计学意义（均P < 0.05）。与对照组比较，Ps组和BPH组tPSA指标均差异具有统计学意义（均P < 0.05）。fPSA%指标在对照组与Ps组以及BPH组间比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）。Ps组和BPH组tPSA和fPSA%指标比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）。患者前列腺体积计算公式为0.52×（前列腺前后径×前列腺上下径×前列腺左右径）。PCa组、Ps组以及BPH组和对照组前列腺体积和年龄比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05，表 1）。

2.2 EPS中EZH2表达水平分析

结合ELISA和RT-PCR检测4组EPS中EZH2的表达情况，PCa组EPS中EZH2的表达水平均高于其他组，差异均具有统计学意义（均P < 0.05，图 1）。Ps组以及BPH组与对照组EPS中EZH2表达水平比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）。

2.3 EPS中EZH2 mRNA相对表达量与PCa临床病理特征的关系

通过Spearman相关性分析，分析PCa患者EPS中EZH2 mRNA相对表达量与Gleason评分、血清PSA和TNM分期等指标之间的相关性。EZH2 mRNA相对表达量在Gleason评分/分化程度方面比较，差异具有统计学意义（P < 0.05，表 2），EZH2表达随着肿瘤分化程度的降低而上调。EZH2 mRNA相对表达量在血清PSA和TNM分期方面比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）。

2.4 PCa指标与患者病理特征的相关性

采用Spearman相关性分析探讨35例PCa患者tPSA、fPSA%和EZH2 mRNA相对表达量指标与Gleason评分、TNM分期、年龄和前列腺体积的相关性，结果显示，仅EZH2 mRNA相对表达量与Gleason评分呈正相关（r=0.644，P < 0.01；表 3）。

2.5 PSA和EPS EZH2 mRNA相对表达量诊断PCa的敏感度和特异度

ROC曲线显示，EPS中EZH2 mRNA相对表达量诊断PCa的AUC高于PSA（0.966 vs 0.649）。当EZH mRNA相对表达量取0.55时，其敏感度为97.1%，特异度为87.9%（图 2）。

3 讨论

EZH2属于Polycomb Group（PcG）基因家族，不仅与PCa细胞的增殖和细胞周期的调控有关，还与PCa的进展及预后有关^[8-9]。EZH2在局部晚期PCa中高表达时提示更差的预后^[10]。有研究表明，EPS脱落细胞学检查诊断PCa特异度为100%，但其总体敏感度较低（6/47，12.8%），即使在PSA≥20 ng/mL的患者中有更高的敏感度（6/14，42.9%），仍不能满足临床检测PCa的需要^[11]。现阶段还未见选用EPS中EZH2的表达来判断PCa诊断价值的相关报道。

由于PCa患者年龄普遍较大，EPS获取较为困难，往往不能获取足够量的EPS或含有足够多的PCa细胞的EPS来进行研究。本研究通过经直肠超声引导提取EPS，远优于单纯的前列腺按摩^[12]；对于需要穿刺确诊PCa的患者，选用在超声探头引导下获取适量的EPS，这也是对于高龄患者提取EPS的一种全新的方式。

本研究通过对PCa患者EPS中EZH2 mRNA和蛋白的检测，确定EZH2的高度特异性表达，其含量高于BPH、Ps和健康人群。Farran-Matas也表明，EZH2在PCa的发生和发展中发挥着重要作用^[13]。在PCa细胞中抑制EZH2的表达可以导致细胞生长阻滞，肿瘤移植瘤生长缓慢；而在前列腺正常上皮细胞中使EZH2过表达后，可促进细胞增殖、侵袭和恶性化转移^{[4, 14]}。本研究结果还表明，PCa患者EPS中EZH2 mRNA的表达水平相较于EZH2蛋白更为明显，故而选用EZH2 mRNA作为深入研究的指标。PCa组EPS中EZH2 mRNA的表达高于BPH组、Ps组及对照组，提示EPS中EZH2可能可以作为PCa的潜在诊断指标。有研究表明，EZH2表达增加与PCa的Gleason高评分存在相关性^[15]，故本研究也证明EPS中EZH2表达越高，Gleason评分越高，PCa分化程度越低。由此可见，EPS中EZH2水平在PCa诊断方面展现良好的特异性，除此之外其含量与PCa进展也有关，可能对局部晚期PCa的治疗有一定的指导作用^[16]。

EZH2在肿瘤诊断和判断预后方面有重要价值。有meta研究分析51项研究中9 444例患者，包括18种肿瘤，如乳腺癌、肺癌、结直肠癌、泌尿系肿瘤和妇科肿瘤等，EZH2高表达者的患病率为0.54（95%CI: 0.47~0.61），EZH2高表达与不良预后相关^[17]。本研究通过ROC曲线表明，与传统检测指标PSA比较，EZH2 mRNA相对表达量诊断PCa的ROC AUC增大，诊断效能提高，当EPS中EZH2 mRNA相对表达量取0.55时，其敏感度为97.1%，特异度达到87.9%。由此可见，EPS中EZH2的表达水平对于诊断PCa具有较好的诊断效能，在一定程度上也有助于穿刺活检时机的把握，尽可能减少不必要的前列腺穿刺活检。本研究将进一步扩大样本量，验证相关结果，以期寻找到诊断PCa的新方法，从而减轻前列腺穿刺带给患者的痛苦。此外，EPS EZH2 mRNA作为潜在PCa检测指标还需克服检测方法的选择困难和诊断点确定等问题，两者可能是将来EPS EZH2 mRNA研究的关键点。