在我国, 约70%的胃癌患者在确诊时已处于晚期, 失去根治性手术的机会^[1]。目前, 尚无针对晚期胃癌的标准治疗方案, 2种或3种药物联合化疗是治疗该病的主要方法^[2]。氟尿嘧啶联合其他化疗药物是临床上最常用的治疗方案, 但约有50%的晚期胃癌患者对治疗不敏感^[3]。与此同时, 目前临床尚不明确哪些生物标志物可以有效预测晚期胃癌患者的化疗敏感性。虽然已有多种生物标志物被用于预测氟尿嘧啶的敏感性, 包括胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TS)、胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase, TP)、二氟嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidine dehydrogenase, DPD)和细胞色素P450酶2A6(human cytochrome P450, family 2, subfamily A, polypeptide 6, CYP2A6), 但其有效性值得商榷^[4-5]。因此, 识别与氟尿嘧啶敏感性相关的生物标志物仍是当务之急。

越来越多的研究表明, 某些基因的异常甲基化可能在胃癌的发生和发展过程中起着关键作用, 通过DNA甲基化分析可以为胃癌患者的早期筛查、疗效和预后评估提供信息^[6]。近期有研究发现, 基因的异常甲基化可能参与胃癌的发生和预后^[7]。其中, p16和RUNT相关转录因子3(human runtrela tedtran-scription factor 3, RUNX3)的高甲基化在胃癌中较为常见^[8]。有研究发现, 广泛存在基因高甲基化的患者总体生存率较低, 认为基因甲基化与化疗敏感性之间存在关联^[9]。然而, 由于缺乏令人信服的临床验证, 基因甲基化在预测胃癌化疗敏感性方面的有效性仍不确定。本研究旨在探讨p16和RUNX3的甲基化与晚期胃癌患者氟尿嘧啶敏感性的关系, 并寻找氟尿嘧啶敏感性的可能预测因子。

1 资料与方法 1.1 一般资料

选择2015年1月至2017年7月期间, 在阳春市人民医院肿瘤科进行一线氟尿嘧啶联合化疗的67例晚期胃癌患者作为研究对象(胃癌组)。其中男性54例, 女性13例; 年龄18~75岁, 中位年龄58岁。纳入标准:(1)年龄在18~75岁; (2)在化疗前经组织学证实为晚期胃癌; (3) Karnofsky性能状态≥ 70;(4)接受顺铂(静脉滴注, 15~20 mg/m², 治疗5 d)+氟尿嘧啶(静脉滴注, 300~500 mg/m², 治疗5 d)治疗(21 d为1个周期)且完成≥ 2个化疗周期。排除标准:(1)合并其他消化道疾病、严重的系统性疾病或器官衰竭; (2)合并其他全身肿瘤; (3)接受过手术。同期选择阳春市人民医院42例体检健康者作为对照组。其中男性34例, 女性8例; 年龄20~73岁, 中位年龄60岁。胃癌组和对照组在年龄和性别方面比较, 差异均无统计学意义(均P>0.05)。本研究经患者书面知情同意, 且经本院伦理委员会批准。

1.2 患者的反应评估和生存率

根据实体瘤疗效评价标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST)1.1版, 每2个月CT检查评估1次化疗反应^[5], 可将患者分为完全缓解(complete response, CR)、部分缓解(partial response, PR)、疾病稳定(stable disease, SD)和疾病进展(progressive disease, PD)4个等级。其中, CR和PR患者定义为应答者, SD和PD患者定义为无应答者。门诊随访截止至2018年10月, 记录分析疾病进展和导致死亡的原因, 无失访者。从一线化疗的第1天开始计算无进展生存(progression free survival, PFS)时间和总生存(overall survival, OS)时间。

1.3 方法 1.3.1 血浆标本分析

对胃癌组(化疗前和化疗后)和对照组进行静脉穿刺采集乙二胺四乙酸血样。血浆标本在1 500 r/min室温下离心15 min, 分离血浆, 并置于-80℃下储存, 直到DNA提取。

1.3.2 DNA提取

用QIAamp DNA Blood mini试剂盒(QIAGEN公司, 德国)从血浆中提取基因组DNA。将500 μL血浆与500 μL工作溶液混合, 在60℃下反应10 min。然后按照制造商的说明书进行DNA分离。DNA纯度应用紫外分光光度与琼脂糖凝胶电泳测定, 将DNA样品置于-20℃下保存使用。

1.3.3 甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)

根据Qiagen Epitect Plus DNA bisulfte试剂盒(QIAGEN公司, 德国)的说明书, 对提取的DNA进行最高2 μg的亚硫酸氢盐转化。PCR反应在25 μL的总体积中进行, 每个反应含有2.5 μL 10×PCR缓冲液、0.5 μL50 mmol/L MgCl₂、1 μL 10 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸、0.5 μL正向引物(10 mmol/L)、0.5 μL反向引物(10 mmol/L)和1 μL模板修饰的DNA。将修饰的DNA储存在-20℃下, 并用作下列检测的模板。

p16和RUNX3基因的引物根据先前的报道^[10]使用PyroMark AssayDesign 2.0软件(QIAGEN公司, 德国)设计并由Life Technology公司合成。p16正向和反向引物去甲基化和甲基化的碱基顺序分别为:5'-GTTGTTAAATAGATATGTTATGT-3'和5'-CTAAAAACTAAAAACTTTCCACA-3'; 5'-TCGTTAAATAGATACGTTACGC-3'和5'-TAAAAACTAAAAACTTTCCGCG-3'。RUNX3正向和反向引物去甲基化和甲基化的碱基顺序分别为: 5'GGTTTTGTGAGAGTGTGTTTAG-3'和5'-CACTAACAAACAAACCAAAC-3';5'-GCTA ACAAAGCGGAACCG-3'和5'-GCTAACAAAGCGGAACCG-3'。根据提供的说明书, 用EPIK扩增试剂盒(QIAGEN公司, 德国)进行PCR。25 μL PCR系统包括2个EPIK扩增混合物(12.5 μL)、正向引物(0.6 μL)、反向引物(0.6 μL)、DNA模板(0.5 μL)和ddH2O (10.8 μL)。MS-PCR的条件如下:95℃热启动2 min; 95℃持续15 s, 56℃持续15 s, 72℃持续30 s, 40次循环; 4℃保持。将p16和RUNX3的扩增产物加载到2%琼脂糖凝胶上电泳, 用溴化乙锭染色并在紫外光下观察。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行数据分析。采用Pearson's χ²检验评估基因甲基化状态与临床病理特征和临床反应之间的关系。采用Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank检验描述PFS或OS。对于连续变量采用均数±标准差($\bar x \pm s$)表示, 组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 血浆标本中p16和RUNX3的甲基化情况分析

采用MS-PCR对对照组和胃癌组血浆标本中p16和RUNX3基因的DNA甲基化频率进行研究。化疗前胃癌组p16和RUNX3的甲基化频率均高于对照组[61.2%(41/67)vs 0.0% (0/42), 70.1% (47/67) vs 11.9%(5/42);均P < 0.01]。与化疗前比较, 化疗后胃癌组p16和RUNX3的甲基化频率分别降低至47.8%(32/67; χ²=5.05, P=0.025)和47.8%(38/67; χ²=2.61, P=0.106; 图 1)。

2.2 基因甲基化与临床病理特征的相关性

胃癌血浆标本中p16和RUNX3基因甲基化在年龄、性别、组织学分化、Lauren分型、腹膜转移和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)状态方面比较, 差异均无统计学意义(均P>0.05, 表 1)。以胃为主要肿瘤部位的患者, 其血浆标本中p16和RUNX3的甲基化频率均高于以胃食管交界处为主要肿瘤部位的患者(均P < 0.05)。

2.3 p16和RUNX3基因甲基化与临床反应及生存时间的关系

p16和RUNX3甲基化阳性患者对氟尿嘧啶化疗的应答率均低于甲基化阴性患者[17.1%(7/41)vs 42.3%(11/26), P=0.023; 19.1%(9/47)vs 45.0% (9/20), P=0.029)]。p16和RUNX3甲基化阳性患者的中位PFS和中位OS与p16和RUNX3甲基化阴性患者比较, 差异均无统计学意义(均P>0.05, 表 2)。

3 讨论

当前临床对于晚期胃癌患者主要采用氟尿嘧啶与其他药物联合化疗进行治疗。但是, 在化疗同时也要注意常见的耐药性问题, 应了解确定化疗敏感性的预测标志物。已有越来越多的证据表明, 基因甲基化在胃癌的发生和进展中起着关键作用^[7]。目前的研究虽然提供有关胃癌患者疗效和预后评估的信息, 但是基因甲基化能否作为有效化疗的预测生物标志物仍缺乏令人信服的临床验证^[11-12]。本研究以67例接受氟尿嘧啶化疗的晚期胃癌患者为研究对象, 对p16和RUNX3基因进行基因甲基化与临床反应的相关性研究。p16和RUNX3异常甲基化被发现是癌症的特异性特征。这2种基因在患者血浆中甲基化的频率高于对照组, 表明其在胃癌的发生中起着一定的作用, 这与过往研究结果一致^[8]。然而, 除了p16和RUNX3甲基化经常发生在胃部肿瘤中, 2种基因的甲基化在临床病理特征如组织分化、Lauren分型、腹膜转移和HER2状态方面比较, 差异均无统计学意义(均P>0.05), 其确切机制目前尚不清楚。

p16作为细胞周期调控因子, 是编码细胞周期蛋白D依赖性蛋白激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)和CDK6的抑制剂, 调控细胞周期从G1期到S期的过程^[13]。p16失活作为一种重要的肿瘤抑制因子, 参与包括胃癌在内的人类癌症的发生和发展。p16基因的失活模式主要通过缺失和启动子高甲基化来实现^[14]。研究表明, p16在胃癌患者的血样中具有高甲基化水平, 可用于甲基化特异性PCR评价^[15]。此外, 在接受辅助性氟尿嘧啶治疗的结肠癌患者中, p16甲基化与较短的无瘤生存时间(disease free survival, DFS)和OS相关^[16]。然而, 在晚期胃癌中, p16对化疗敏感性的临床意义尚不清楚。本研究中, p16甲基化阳性患者化疗应答率低于阴性患者。此外, p16甲基化阳性患者的预后有劣于阴性患者的趋势, 但差异无统计学意义(P>0.05)。

RUNX3是一种在发育过程中调节谱系特异性基因表达的转录因子, 参与多种癌症的形成^[8]。RUNX3通过控制众多参与胃上皮细胞生长、凋亡和分化的基因表达以及参与血管生成和细胞连接形成的基因表达, 发挥抑癌作用^[17]。越来越多的证据表明, RUNX3是一种肿瘤抑制因子^[10]。RUNX3在腺胃上皮细胞中表达, 而RUNX3基因的过度甲基化与胃癌的发生和发展有关, 并与胃癌的分化、转移和预后不良有关^[8]。同时研究发现, 与健康对照组比较, RUNX3基因的启动子区域甲基化在胃癌患者血浆中更常见, 这表明RUNX3基因的启动子区域甲基化可能诱发胃癌的发生和发展^[18]。在接受辅助性氟尿嘧啶治疗的结直肠癌患者中, RUNX3启动子区域甲基化与铂、氟尿嘧啶和其他药物的耐药性相关^[16]。在本研究中, RUNX3甲基化阳性患者化疗应答率低于阴性患者。

综上所述, p16和RUNX3基因甲基化在晚期胃癌患者血浆中较为常见且特异性强。2种基因的甲基化状态均与患者对氟尿嘧啶化疗的反应密切相关, 可以考虑作为预测晚期胃癌治疗效果的生物标志物。但仍需要通过进一步的体外或动物研究来阐明其分子机制以及通过前瞻性的临床研究来确认p16和RUNX3甲基化是否可以用于确定受益于氟尿嘧啶化疗的晚期胃癌患者。