肺癌已成为全球发病率最高的恶性肿瘤，其中 > 90%的患者被诊断为非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）^[1]，患者预后不佳，5年生存率较低^[2]。肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor, c-Met）是一种由原癌基因c-Met编码的蛋白产物^[3]。c-Met作为一种跨膜受体蛋白，已经发现在胃癌^[4]、大肠癌^[5]和胰腺癌^[6]中过表达，与肿瘤的恶性增殖和远处转移密切相关。磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（glypican 1，GPC1）是一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖，是肝素结合生长因子的共受体。研究发现，GPC1在乳腺癌^[7]、子宫颈癌^[8]以及脑胶质瘤^[9]中存在异常表达。本研究拟分析c-Met和GPC1在NSCLC组织及其癌旁组织中的表达情况，并分析其表达与患者临床病理资料之间的关系，对患者进行为期5年的预后随访。

1 资料与方法 1.1 一般资料

收集本院于2012年1月至2014年1月确诊治疗的234例NSCLC患者肿瘤组织及癌旁组织。其中男性160例，女性74例；年龄45~85岁，平均年龄65岁；< 60岁77例，≥60岁157例。有吸烟史99例，无吸烟史135例。临床分期：Ⅰ~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期分别有108例和126例；病理类型：鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌和其他类型分别有94、104、6、10和20例，104例腺癌中含52例混合型腺癌、39例腺泡型腺癌、7例乳头状腺癌及6例实性腺癌；分化程度：低、中和高分化分别有86、102及46例。有和无淋巴结转移病例分别为110和124例。按照肿瘤部位分类有120例中央型和114例周围型。所有患者均采用电话随访5年进行预后统计。患者及家属均签署知情同意书。排除标准：临床资料不完整以及严重肝、肾脏器功能不全者。

1.2 方法 1.2.1 试剂

兔抗人c-Met单抗购自上海善然生物科技有限公司。兔抗人GPC1单抗购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。DAB显色剂购自上海烜雅生物科技有限公司。苏木精购自上海宝曼生物科技有限公司。c-Met二抗购自上海北诺生物科技有限公司。GPC1二抗购自上海钰博生物科技有限公司。

1.2.2 免疫组织化学染色

将肿瘤组织和癌旁组织分别进行石蜡包埋并切片，脱蜡水化后清洗切片。加入阻断液后封闭处理，分别加入c-Met一抗(1:100稀释）和GPC1一抗(1:700稀释）溶液，4℃孵育24 h后清洗，加入对应的二抗溶液孵育30 min后清洗，链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶溶液室温孵育30 min后再次清洗，DAB显色剂进行显色处理后清洗，苏木精对比染色后封固，显微镜下观察。

免疫组织化学实验结果评定^[10]按染色深浅度积分和染色细胞阳性率评分。染色深浅度积分：0分为无染色，1分为浅染色，2分为棕黄色染色，3分为深棕黄色染色。染色细胞阳性率评分：0分为没有阳性细胞，1分为 < 10%的阳性细胞，2分为10%~50%的阳性细胞，3分为 > 50%~100%的阳性细胞。将上述2种积分相加，< 4分为阴性表达，≥4分为阳性表达。

1.3 统计学分析

采用SPSS21.0软件进行统计学分析。计量资料采用t检验。计数资料采用χ²检验。Spearman进行相关性分析。Kaplan-Meier(K-M）法进行预后生存分析。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 肺癌组织中c-Met和GPC1的表达

c-Met阳性表达主要在肿瘤细胞胞质和胞膜。c-Met在肺癌组织和癌旁组织中的表达阳性率分别为68.0%（159/234）和8.6%（20/234），差异具有统计学意义（P < 0.05）。GPC1阳性表达主要在肿瘤细胞胞膜。GPC1在肺癌组织和癌旁组织中的表达阳性率分别为79.1%（185/234）和20.9%（49/234），差异具有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 肺癌组织中c-Met和GPC1表达与患者临床病理资料的关系

在肺癌组织中，c-Met阳性表达在NSCLC患者的临床分期、淋巴结转移和分化程度方面差异均具有统计学意义（均P < 0.05）；GPC1阳性表达在NSCLC患者的临床分期和淋巴结转移方面比较，差异均具有统计学意义（均P < 0.05）；两者的阳性表达在患者的性别、年龄、是否吸烟、肿瘤组织病理类型及肿瘤部位方面比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05，表 1）。

2.3 c-Met与GPC1在肿瘤组织中的表达相关性

在NSCLC患者的肿瘤组织中，c-Met蛋白和GPC1蛋白的表达呈正相关（r=0.706，P < 0.01，表 2）。

2.4 生存时间

对所有纳入研究的患者进行为期5年的预后随访。GPC1阳性患者的5年生存率低于GPC1阴性患者，差异具有统计学意义（12.6% vs 56.3%，χ²=22.58，P < 0.01）。c-Met阳性患者的5年生存率低于c-Met阴性患者，差异具有统计学意义（5.3% vs 28.5%，χ²=17.84，P < 0.01；图 1）。

2.5 预后影响因素

对上述多个变量进行回归分析发现，c-Met阳性表达、GPC1阳性表达、NSCLC临床分期以及淋巴结转移是NSCLC患者生存时间的主要影响因素（均P < 0.01, 表 3）。

3 讨论

目前已知的所有恶性肿瘤中，肺癌的发病率和死亡率均居首，其中以NSCLC最多见。NSCLC在临床病理类型中主要类型有2类，即腺癌和鳞癌^[11]。传统的放化疗方法虽能暂时缓解患者的痛苦，但预后较差，5年生存率 < 15%^[12]。

目前学术界普遍认为肿瘤新生血管生成是肿瘤生长和发展的基础，新生血管生成则是由多种因素综合长期影响的结果^[13-15]。近年来研究发现，由原癌基因c-Met编码的跨膜受体蛋白c-Met蛋白能够刺激内皮细胞的分化和迁移等过程，最终可以有效促进新生血管生成^[16]。研究显示，NSCLC患者肿瘤组织中c-Met过表达，超出正常组织近3倍表达量^[17]；肺癌中c-Met的表达与肺癌的临床分期有关^[18]。c-Met的表达量与肺癌的分化程度存在关联，分化程度越高，表达量越高^[19]。多项研究结果均表明，c-Met的表达参与NSCLC的发生和发展过程^[20-21]。GPC1是一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖，通过糖基磷脂酰肌醇附着于细胞膜表面^[22]。在多种肿瘤细胞上呈过表达状态，如乳腺癌、子宫颈癌以及脑胶质瘤等。GPC1的过表达与肿瘤细胞的增殖、转移及新生血管生成之间存在密切的关联性^[23]。在肿瘤患者的外周血血清中可以检测到GPC1阳性的外泌体^[24]。胰腺癌组织中GPC1过表达，可以作为胰腺癌总生存率的独立预后指标^[25]。

本研究结果显示，在NSCLC组织中，c-Met和GPC1蛋白均过表达，与以往研究结果一致^[26-28]。相关性分析发现，在NSCLC组织中c-Met和GPC1蛋白的表达呈正相关（r=0.706，P < 0.01），提示两者可能发挥协同作用，共同促进NSCLC的发生和发展过程。c-Met与GPC1在NSCLC组织中的阳性表达与患者的临床分期和淋巴结转移有关。生存分析结果发现，c-Met阴性表达和GPC1阴性表达患者的5年生存率均高于对应阳性表达患者。通过预后影响因素分析发现，c-Met阳性表达、GPC1阳性表达、NSCLC临床分析以及淋巴结转移是NSCLC患者生存时间的主要影响因素（均P < 0.01）。

综上所述，NSCLC患者肿瘤组织中c-Met和GPC1阳性表达且预后不良，两者表达呈正相关，提示可能共同作用、协同促进NSCLC的发生和发展。本研究结论可能为NSCLC患者的临床靶向治疗提供参考依据。