食管癌是危害人类健康的恶性肿瘤之一，居于全球人类癌症死亡的第6位^[1]。食管鳞状细胞癌是食管癌的主要组织学类型。其恶性程度高，预后差，对放疗不敏感，患者死亡率高。目前食管癌的研究有诸多突破性进展，放疗和化疗仍是治疗食管癌的主要手段，但部分化疗药物的严重不良反应降低了患者的生活质量^[2-3]。食管癌术后存在一定的复发率，因此研发治疗食管癌的有效化疗药物意义重大。藤黄酸（gambogic acid）是由藤黄分泌的主要活性成分，具有抗感染、抗癌和抗氧化等多种功效^[4-6]。藤黄酸可通过多种机制抑制肿瘤细胞的活性，包括抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移以及诱导细胞的凋亡^[7]。尽管藤黄酸在各种癌症中均显示较强的抗肿瘤活性，但其诱导食管癌细胞凋亡是否与Janus激酶（Janus kinase，JAK）-信号转导与转录激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路有关尚不明确。为此，本研究目的在于探讨藤黄酸对食管癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响，探讨其可能的作用机制，为临床应用提供实验基础。

1 材料与方法 1.1 细胞株和试剂

藤黄酸购自上海蓝木化工有限公司，溶解于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配置成储存液体（50 mmol/L），分装后于-20℃冰箱保存，食管癌细胞株KYSE450由中国医学科学院肿瘤医院重点实验室友情提供；JAK2、STAT3、磷酸化的Janus激酶2（phosphorylated Janus kinase 2，P-JAK2）、P-STAT3、Bax、Bcl2、Cleaved PARP1、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9购自武汉三鹰生物技术有限公司，β-actin、抗鼠二抗和抗兔二抗购自美国Sigma公司；凋亡试剂盒购自上海碧云天生物有限公司；蛋白质印迹试剂购自广州康为生物科技有限公司；CCK-8试剂购上海碧云天生物有限公司；RPMI 1640细胞培养液、胎牛血清和胰蛋白酶均购自美国Gibco公司。

1.2 细胞培养

细胞采用含有10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的RPMI 1640培养液，在37℃ 5%CO₂细胞培养箱中无菌培养。每隔24 h换液1次。细胞生长至大皿密度的70%左右，用胰酶消化传代。待细胞贴壁后，取对数生长期的细胞进行相关实验。

1.3 细胞增殖抑制试验

取对数生长的食管癌细胞KYSE450，胰酶消化后计数，分别以每孔2 000个细胞均匀接种在96孔板里。待24 h细胞贴壁去除培养液，分别加入浓度为0.5、1.0和2 µmol/L的藤黄酸和DMSO进行对照，每个浓度6个副孔。分别培养24、48和72 h后，每孔100 μL培养液加入CCK-8 10 μL，在培养箱培养2 h后，酶标仪上测定450 nm吸光度（absorbance，A）值，根据A值通过公式计算细胞抑制率（%）=（1-实验组A值/对照组A值）×100%，实验重复3次取平均值。

1.4 细胞克隆形成实验

取对数生长期的食管癌细胞KYSE450均匀接种在6孔板内，分别加入浓度为0.5 µmol/L和1 µmol/L的藤黄酸，DMSO进行对照。24 h后应用电子显微镜观察细胞形态和数目。用胰酶进行消化后，离心计数，以每孔300个细胞均匀接种在12孔板上，于培养箱中继续培养14 d，去除培养液，甲醇固定后，用结晶紫染色并于显微镜下进行集落计数。

1.5 细胞侵袭和迁移实验

细胞侵袭实验提前6 h将含2% Matrigel的100 μL无血清RPMI 1640加入transwell上室，放置于37℃培养箱；取对数生长的食管癌细胞KYSE450，胰酶消化均匀接种在6孔板里，待24 h贴壁后分别加入浓度为0.5 µmol/L和1 µmol/L的藤黄酸以及DMSO进行对照。24 h后消化细胞离心，用不含血清的RPMI 1640重悬后计数；每孔100 000个细胞重新悬浮在无血清培养液中，并均匀地接种到transwell板的上室中。将700 μL含30%胎牛血清的培养液加入下室。培养24 h后，取出上室甲醇固定10 min，然后用0.5%结晶紫染色10 min。使用显微镜对侵袭和迁移的细胞进行拍照和定量。

1.6 细胞凋亡实验

使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒通过流式细胞术测定细胞凋亡。分别用浓度为0.5 µmol/L和1.0 µmol/L藤黄酸以及DMSO进行对照，处理48 h后收集贴壁细胞和漂浮细胞，并用5 μL膜联蛋白V-FITC（0.5 mg/mL）孵育15 min，避光加入5 μL PI（0.5 mg/mL）染色15 min。用BDTM LSRⅡ流式细胞仪进行上机分析。计算膜联蛋白阳性细胞并定义为凋亡细胞。

1.7 Western blot实验

用0.5 µmol/L和1.0 µmol/L藤黄酸以及DMSO进行对照处理食管癌KYSE450细胞24 h。用PBS洗涤1次后，使用含有40 μg/mL蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的NP-40裂解缓冲液提取细胞样品的总蛋白。使用BCA蛋白质测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）根据制造商的说明书测定蛋白浓度。将等量40 μg蛋白质在SDS-PAGE 10%凝胶中进行电泳，然后转移到PVDF膜（Millipore，USA）上。用5%脱脂乳封闭1 h后，在4℃下与一抗孵育过夜。TBST洗膜3次每次10 min，在室温下与辣根过氧化物酶缀合的二抗孵育1 h后，TBST洗膜3次每次10 min后通过ECL测定试剂盒观察蛋白质条带，并使用ChemiDoc TM XRS + System进行分析。

1.8 统计学分析

使用SPSS13.0和GraphPad Prism 7软件进行数据分析及作图。数据采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 藤黄酸抑制食管癌KYSE450细胞的增殖

藤黄酸的化学分子结构见图 1。用不同浓度的藤黄酸（0、0.5、1.0和2 µmol/L）处理食管癌细胞株KYSE450 24、48和72 h，通过CCK-8测定法评估每种浓度和时间点的细胞抑制率发现，藤黄酸以浓度依赖性和时间依赖性方式抑制细胞增殖（均P < 0.05，图 2）。

2.2 藤黄酸抑制食管癌KYSE450细胞的克隆形成

用不同浓度的藤黄酸（0、0.5和1 µmol/L）处理食管癌KYSE450细胞24 h后，克隆形成试验表明，藤黄酸以剂量依赖性方式抑制食管癌KYSE450细胞的克隆形成（均P < 0.05，图 3）。

2.3 藤黄酸抑制食管癌KYSE450细胞的迁移和侵袭

不同浓度的藤黄酸（0、0.5和1.0 µmol/L）处理KYSE450细胞24 h后，transwell小室实验中，在荧光倒置显微镜下观察到0.5和1.0 µmol/L藤黄酸处理的KYSE450细胞的迁移和侵袭的细胞数少于对照组（均P < 0.05，图 4）。

2.4 藤黄酸诱导食管癌KYSE450细胞凋亡

流式细胞仪结果显示用不同浓度的藤黄酸（0、0.5和1.0 µmol/L）处理KYSE450细胞48 h，基于膜联蛋白V-FITC/PI双重染色和流式细胞仪检测细胞凋亡的比例分别为（2.1±0.18）%、（5.8±0.49）%和（7.7±0.37）%，对照组与另两组比较，差异均具有统计学意义（均P < 0.05，图 5）。

2.5 藤黄酸通过抑制JAK-STAT信号通路诱导食管癌KYSE450细胞凋亡

Western blot结果显示，用不同浓度的藤黄酸（0、0.5和1 µmol/L）处理的KYSE450细胞48 h后，与对照组（0 µmol/L）比较，其他两组的抗凋亡蛋白Bcl2的表达降低，凋亡相关蛋白Bax、促凋亡因子Cleaved PARP1、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达量均逐渐增加（均P < 0.05，图 6A)。进一步验证藤黄酸通过抑制JAK-STAT信号通路诱导食管癌KYSE450细胞凋亡，与对照组比较，P-JAK2和P-STAT3蛋白表达量降低呈剂量依赖性（均P < 0.05），而JAK2和STAT3蛋白表达量基本不变（图 6B），表明藤黄酸通过JAK-STAT信号通路诱导食管癌细胞凋亡。

3 讨论

食管癌的5年生存率较低（10%~30%）。多数中晚期食管癌伴有远处转移，部分已错失手术机会，然而化疗是治疗中晚期食管癌的有效方案之一，但化疗不良反应大，影响患者生活质量^[8]。天然小分子药物具有很强的抗癌效果，并且不良反应小，有可能为一种治疗癌症的新方法^[9]。藤黄酸是藤黄分泌的天然成分，具有抗感染、抗微生物和抗肿瘤的活性^[10]。虽然藤黄酸在某些肿瘤中具有极有效的抗肿瘤作用，但对食管癌的作用机制仍不十分明确。本研究表明，藤黄酸能抑制食管癌细胞KYSE450的增殖、迁移和侵袭，且随着藤黄酸浓度的增加以及作用时间的延长，藤黄酸对食管癌细胞KYSE450的作用增加。进一步研究发现，藤黄酸能抑制JAK-STAT信号通路并诱导食管癌KYSE450细胞凋亡。

浸润生长和远处转移是恶性肿瘤的基本特性之一。肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位、淋巴管、血管或体腔继续生长到其他部位的过程，这与癌症进展密切相关^[11-12]。藤黄酸在多种肿瘤细胞中均具备抑制和杀伤肿瘤细胞的作用。本研究表明，藤黄酸可以有效抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，随着藤黄酸浓度的增加和作用时间的延长，这种抑制效果更明显。

本研究发现，与对照组细胞学形态比较，藤黄酸处理组的细胞形态学均有异常改变，且呈现剂量依赖性和时间依赖性，可证明藤黄酸能够促使食管癌细胞株KYSE450发生形态学的变化，这也为藤黄酸具有抑制恶性肿瘤细胞的增殖奠定基础。并且本次实验证明，藤黄酸具备抑制食管癌细胞的克隆形成能力，进一步也验证了抑制食管癌细胞增殖的能力。

细胞凋亡是指由基因控制以维持体内平衡的细胞的有序死亡。凋亡检测是药物抗肿瘤机制研究中的重要手段^[13-14]。本研究证明，藤黄酸可以促进食管癌细胞KYSE450的凋亡，并且以剂量依赖性方式增加细胞凋亡中早期和晚期细胞的比例。由抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白组成的Bcl2家族蛋白是线粒体功能的重要调节剂。Bcl2属于抗凋亡蛋白，抑制细胞凋亡，而Bax作为促凋亡蛋白起作用并激活细胞凋亡。Bax/Bcl2比率对细胞存活和凋亡有一定意义。增加的Bax/Bcl2比率导致细胞色素c从线粒体释放和Caspase-3激活，然后剪切体的PARP在内的细胞内底物诱导细胞凋亡^[15]。实验结果显示，藤黄酸处理导致Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP1上调，藤黄酸处理增加Bax蛋白水平并降低Bcl2蛋白水平，导致Bax/Bcl2比率增加。因此，本研究结果表明，藤黄酸通过线粒体相关的凋亡途径诱导食管癌细胞KYSE450产生凋亡。

JAK-STAT信号通路是调节细胞增殖、分化、迁移和凋亡的重要信号通路之一^[16]。研究表明，突变的JAK蛋白可能是抗肿瘤治疗的有效靶点^[17]。在本研究中，藤黄酸抑制食管癌细胞KYSE450 JAK2和STAT3的磷酸化，提示藤黄酸的抗肿瘤作用是通过抑制JAK-STAT信号通路而实现的，提示藤黄酸通过抑制JAK-STAT信号通路诱导食管癌KYSE450细胞凋亡。

目前随着临床治疗方案的不断创新与发展，肿瘤的靶向治疗和研发新的分子靶向药物成为肿瘤治疗的热点方案^[18]。本研究再次证明，藤黄酸具有良好的抗癌作用。本研究首次发现藤黄酸可以通过JAK-STAT信号诱导食管癌细胞凋亡并且有抑制其增殖的能力，然而藤黄酸的实际临床效果还需进一步的体内实验验证。

综上所述，藤黄酸能抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并且通过抑制JAK-STAT信号通路诱导食管癌细胞凋亡，揭示该药物的新抗癌机制，为今后的临床应用提供了实验基础。