经典型骨肉瘤（conventional osteosarcoma，COS）是高度恶性的骨肿瘤，占骨肉瘤的绝大多数。COS进展迅速，复发和转移发生率高，患者预后差，生活质量不佳^[1]，急需深入研究以开发新的治疗靶点及判断预后。发状分裂相关增强子1（hairy and enhancer of split 1，Hes1）是碱性螺旋-环-螺旋蛋白（basic helix-loop-helix，bHLH）家族成员，含有DNA结合结构域，具有靶基因转录抑制作用，在干细胞和前体细胞分化及维持干性表型方面起重要作用^[2]。Hes1的转录主要受经典的NOTCH调控，在恶性肿瘤中发挥重要作用，和肿瘤发生、分化和肿瘤干细胞等有关^[3-4]。目前Hes1在骨肉瘤中的表达水平及作用仍不清楚，因此本研究检测COS标本中Hes1蛋白的表达，并分析其表达与骨肉瘤患者临床病理特征、肿瘤术后进展及预后的关系。

1 资料与方法 1.1 病例资料

收集本院2007年4月至2016年10月初诊初治并明确诊断的56例COS标本。病理诊断经 > 2名副主任医师复诊确认。收集本组病例的临床病理特征，包括性别、年龄、发病部位、切除方式、术前化疗与否、肿瘤最大直径及Ennecking分期等。本研究经中国人民解放军南部战区总医院医学伦理委员会批准通过，组织样本收集均获得患者签署知情同意书。

1.2 免疫组织化学实验

所有标本经4%甲醛固定、石蜡包埋、4 μm厚连续切片。免疫组织化学实验经过烤片和脱蜡后使用3%双氧水孵育10 min以去除内源性过氧化物酶活性。切片经EDTA高温高压修复后，按照EnVision法孵育抗体。一抗为Hes1（1∶100，小鼠抗人，购自美国Cell Signaling Technology公司，克隆号D6P2U）。二抗、抗体稀释剂及DAB显色剂均购自丹麦DAKO公司。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3 染色结果判读

Hes1定位于细胞核，以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性，每例切片随机选取10个高倍视野（200倍）的阳性肿瘤细胞进行计数，评分标准：着色评分，阴性为0分，弱阳性为1分，中等阳性为2分，强阳性为3分；阳性细胞占总肿瘤细胞数的百分比评分，≤5%为0分，6%~25%为1分，26%~50%为2分，> 50%为3分；将上述2项评分相乘作为最终结果，0~3分为低表达组，4~9分为高表达组。经2名副主任医师双盲阅片降低误差率。

1.4 随访

所有患者术后及化疗结束后皆进行门诊随访、电子病历和电话追踪。所有患者随访至术后5年。总生存期（overall survival，OS）是指术后第1天至死亡时间。无进展生存期（progression-free survival，PFS）是指从肿瘤切除后到肿瘤复发或转移的时间。末次随访时间为2021年5月。

1.5 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计数资料以频数（百分比）表示。两变量分析采用列联表χ²检验或Fisher精确检验。采用Kaplan-Meier法作生存曲线，使用log-rank检验生存曲线差异。多因素分析采用Cox比例风险模型分析（forward LR法）。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 临床资料

56例COS患者中，男性34例（60.7%），女性22例（39.3%）；年龄7~68岁，平均23岁，中位年龄19岁。发病部位股骨32例（57.1%），胫骨10例（17.9%），肱骨5例（8.9%），腓骨4例（7.1%），骨盆3例（5.4%），锁骨和骨外各1例（1.8%）。接受新辅助化疗41例（73.2%），未接受15例（26.8%）。局部根治术47例（83.9%），截肢术9例（26.8%）。Ennecking分期ⅡA期14例（25.0%），ⅡB期37例（66.1%），Ⅲ期5例（8.9%）。肿瘤直径1.4~18 cm，平均8.15 cm，中位数8 cm。组织学类型骨母细胞型31例（55.4%），软骨母细胞型8例（14.3%），纤维母细胞型17例（30.4%）。

2.2 Hes1表达与COS患者临床病理特征的关系

56例COS患者中，Hes1低表达34例（60.7%），高表达22例（39.3%，图 1）。Hes1高表达和低表达患者的肿瘤平均直径分别为9.47 cm和7.31 cm，差异具有统计学意义（t=-2.434，P=0.018）。在有完整随访资料的患者中，Hes1高表达和低表达患者肿瘤术后复发发生率为54.5%（12/22）和16.7%（4/24），差异具有统计学意义（χ²=7.26, P=0.012）；肿瘤转移发生率为72.7%（16/22）和41.7%（10/24），差异具有统计学意义（χ²=4.506, P=0.042）。Hes1表达在患者性别、年龄、发病部位、接受新辅助化疗、手术方式及Ennecking分期方面比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05，表 1）。

2.3 Hes1表达水平与COS患者生存期的关系

COS患者死亡22例，失访10例，随访率为82.1%。所有患者随访5年OS率为60.7%。Kaplan-Meier法生存分析显示，Hes1低表达和高表达患者比较，5年OS率为67.1%和14.7%；5年内平均OS为52.7个月和38.4个月（χ²=10.588，P=0.001）；5年内平均PFS为48.3个月和22.6个月（χ²=14.998，P < 0.01）。Hes1低表达患者OS和PFS均较高表达患者延长（图 2~3）。

2.4 COS患者预后的独立危险因素

将患者年龄、性别、新辅助化疗情况、Ennecking分期、组织学类型、肿瘤最大直径以及Hes1表达水平纳入Cox多因素分析显示，Hes1表达水平是预测COS患者OS（P=0.002）和PFS（P < 0.01）的独立危险因素（表 2）。

3 讨论

COS是常见的青少年原发性恶性骨肿瘤，约占原发骨肿瘤的15%，恶性程度高，预后不佳，5年OS率约50%~60%^[3]。近年来随着辅助化疗及手术方式的改善，患者预后有所改善，但远期生存率和生活质量仍不理想。COS的化疗抵抗比例较高，进展快，术后复发转移风险高，患者生活质量较差，急需深入研究以发展新的治疗靶点^[5-6]。

HES1是调控细胞分化的关键基因之一，其编码的核内转录抑制因子Hes1是bHLH蛋白超家族的成员，其bHLH结构域使Hes1可以和其他类似蛋白质形成二聚体并发挥作用。Hes家族有7种蛋白（Hes1~7），可以结合DNA并抑制靶基因转录，在干细胞和前体细胞分化及维持干性表型方面起重要作用^[2]。Hes1是NOTCH通路的下游效应分子之一。NOTCH信号途径参与和影响正常干细胞的分化过程并促进多种肿瘤的发生和发展^[7]，活化后经过多步骤形成转录复合物，激活HES1等效应基因的转录^[8]。NOTCH通路的异常激活与多种恶性肿瘤发生相关^[7]。骨肉瘤研究发现，NOTCH通路活化可以增强骨肉瘤细胞的增殖、侵袭及化疗抵抗能力^[9-10]。NOTCH受体表达水平与骨肉瘤患者预后密切相关^[11-12]。除了NOTCH通路以外，Hes1的活性还受到Sonic Hedgehog、应激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和转化生长因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）等信号通路调控。Hes1在肿瘤中主要起促癌作用，除了直接抑制靶基因转录外，还可以结合信号转导和转录活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）以及多聚ADP核糖转移酶[poly（ADP-ribose）polymerase family，member 1，PARP1]等，并上调其活性^[2]。Hes1的表达上调可以促进肿瘤干细胞维持未分化状态^[13]。Hes1通过结合Deltex1启动子而抑制Deltex1表达，从而促进小鼠移植瘤的肺转移^[14]。Hes1还可以通过结合Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor-2，RUNX2）而激活其功能，促进肿瘤转移^[15]。Hes1协同p21在肿瘤化疗抵抗中起重要作用^[16]。Hes1在肿瘤细胞恶性生物学行为调控中处于关键地位，具有重要的研究价值和治疗意义。

已有研究发现，Hes1可以促进骨肉瘤细胞侵袭能力，抑制其功能可以抑制侵袭能力和转移能力^[3]。Hes1的表达和骨肉瘤的化疗抵抗能力有相关性^[17]。Hes1的mRNA表达水平和患者预后呈负相关^[18]。但COS中Hes1蛋白的确切临床病理意义还未有直接阐明。本研究发现，COS标本中Hes1表达水平高低不一。高表达Hes1的肿瘤平均直径大于低表达的肿瘤（P=0.018），提示高表达Hes1的肿瘤生长速度更快，恶性程度更高。高表达Hes1的患者肿瘤术后复发率高于低表达患者（P=0.042），猜测和Hes1高表达的肿瘤侵袭周边组织的能力更强、残留肿瘤细胞化疗抵抗能力更强或和Hes1维持肿瘤干细胞表型有关。高表达Hes1的患者肿瘤转移率也高于低表达的患者（P=0.012），推测和Hes1可以通过多种分子途径增强肿瘤转移能力并增强化疗抵抗的作用有关。生存分析发现，Hes1低表达和高表达患者比较，死亡率更低，OS和PFS均更长。多因素分析显示，Hes1表达是COS患者OS和PFS预后的独立影响因子（均P < 0.05）。以上结果提示Hes1可以为COS患者的手术和术后放化疗方案选择依据，可以将Hes1表达作为COS预后判断的指标之一。

Hes1的基因转录及功能受到NOTCH通路等复杂分子网络调控。本研究仅限于探讨Hes1蛋白表达与骨肉瘤患者临床病理参数及预后的关系，对Hes1在骨肉瘤细胞中的分子调控机制及作用方式未作进一步的探讨。后续，笔者将结合骨肉瘤中NOTCH通路对Hes1调控对Hes1的具体作用作深入探索。本研究使用的样本量有限，下一步将扩大样本量验证相关发现。

综上所述，本研究提出应用Hes1的免疫组织化学评价可以预测COS术后进展及患者预后，为临床选择治疗方法提供依据，并为COS的治疗靶点研究提供新的思路。