胰腺癌是一种高度恶性的肿瘤，全世界每年死亡 > 20万例^[1]。2017年美国癌症协会报告胰腺癌位列癌症相关死亡的第4位，新发胰腺癌达到5.36万例，死亡病例4.31万例, 预计2030年胰腺癌死亡将位列癌症相关死亡的第2位^[2-3]。中国国家癌症中心的统计数据显示，2000年至2011年胰腺癌发病率与死亡率逐渐上升，2015年全国男性和女性胰腺癌发病例数分别为5.22万和3.79万例，死亡例数则分别为4.56万例和3.38万例^[4]。胰腺癌恶性程度高、早期诊断难且生存率低。因此，如何提高胰腺癌早期诊断和治疗效果是目前迫切需要攻克的难题。

MicroRNA (miRNA)是一类分布广泛的小的非编码蛋白质的RNA，通过作用于下游靶基因调控肿瘤细胞生物学功能，在恶性肿瘤的发生和发展过程中发挥重要的作用^[5-7]。研究表明，miRNA可以抑制重要的肿瘤相关基因的表达，在癌症的诊断和治疗中起重要作用^[8]。

胰腺癌的发生和发展是涉及到miRNA在内多种癌基因和抑癌基因参与的过程^[9-11]，然而，国内未见microRNA-122（miR-122）在胰腺癌中作用的报道。因此，本研究拟明确miR-122在胰腺癌中的表达情况及对胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用。

1 材料与方法 1.1 资料和细胞

收集2017年10月至2018年3月在海军军医大学长海医院普外科治疗的20例胰腺癌患者的手术标本，所有标本均经病理组织学确诊。其中男性13例，女性7例；年龄48~71岁，平均59岁。术前签署同意书，患者术后的病理标本用于医学研究均获得患者同意。患者接受手术切除前无放化疗病史。人源正常胰腺导管上皮细胞株（HPDE）和胰腺癌细胞株（ASPC1、PANC1、MP和SW1990）由上海生命科学院健康营养所詹丽杏研究员课题组保藏和提供。HPDE、PANC1、MP和SW1990细胞培养条件：DMEM（美国Hyclone公司）+10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；美国BI公司）+1%青-链霉素双抗（美国Gibco公司）；ASPC1细胞培养条件：RPMI1640（美国Hyclone公司）+10%FBS+1%青-链霉素双抗。于37℃5% CO₂的细胞培养箱中培养。

1.2 miR-122模拟类似物及阴性对照瞬时转染胰腺癌细胞

5 nmol的miR-122模拟类似物和阴性对照干粉（上海吉玛制药技术有限公司）先常温10 000 r/min离心1 min，然后用250 μL无酶水稀释成20 μmol/L的储存液，分装储存于-20℃冰箱，避免反复冻融。依据生产商的说明，利用Lipofectamine 2000（美国Life Technologies公司）转染胰腺癌细胞。

1.3 RT-qPCR检测miR-122表达量

常规提取胰腺癌组织、癌旁组织和细胞中的RNA，用miRNA反转录试剂盒（日本Takara公司）合成cDNA。用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（日本Takara公司）进行实时定量PCR。采用U6作为内参照，运用ABI7900实时荧光定量PCR仪自带软件分析，获得扩增产物Ct值，Ct为反应的实时荧光强度达到设定的阈值时所经过的扩增循环数，结果采用2^-△△Ct法分析mRNA的相对表达量。miR-122上游引物5’- CGGGCTGGAGTGTGACAATG -3’，下游引物5’- CAGCCACAAAAGAGCACAAT -3’；内参U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。miR-122和内参U6的PCR引物及反转录引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR扩增miRNA反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，60℃退火30s，40个循环；最后72℃延伸8 min，4℃保存。实验重复3次。

1.4 MTT法检测细胞增殖能力

取对数生长期细胞，调整细胞密度为5×10⁴/mL，在96孔板每孔中加入200 μL细胞悬液，每组设5个复孔，铺4块96孔板作为4个时间点（24、48、72和96 h）的检测，细胞接种于96孔板中心。分别在培养24、48、72和96 h后每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL，美国Sigma公司）, 继续培养4 h, 吸弃96孔板内培养液终止培养，每孔加入100 μL DMSO（美国Sigma公司），37℃培养箱继续孵育30 min，在酶联免疫检测仪490 nm测量各孔吸光度值。

1.5 伤口愈合实验检测细胞迁移能力

将预先转染成功的胰腺癌细胞以3×10⁵个细胞/孔的量铺到6孔板中，保证细胞过夜能够生长密度达到90%。用200 μL枪头在每孔中进行垂直与横线划痕。PBS清洗3次去掉划痕后脱落漂浮的细胞，加入3 mL无血清空白培养液，放置于细胞培养箱中培养24 h。取细胞划痕后0 h及24 h进行拍照，计算细胞间距离的均值分析迁移能力。

1.6 Transwell检测细胞侵袭能力

Matrigel胶（美国BD Sciences公司）置于4℃过夜预冷。取100 μL Matrigel胶加入BD小室（美国Corning公司）上室，放入37℃培养箱孵育2 h。将BD小室置于24孔板中，小室上部加入200 μL细胞（2×10⁵/mL）。小室下室加入600 μL含有10%FBS的条件培养液。培养24 h后PBS漂洗3遍，4%多聚甲醇（美国Sigma公司）固定30 min，0.1%结晶紫溶液染色30 min，PBS漂净。用棉签拭去小室上室内细胞，小室底部干燥后，显微镜拍照计数。

1.7 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，使用GraphPad Prism 5.0进行图片编辑和处理。实验数据先进行正态性检验和方差齐性检验，不符合正态性检验的数据采用非参数方法分析，符合正态性检验的数据；计量资料的两组间比较差异采用非配对t检验，单因素多组比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 miR-122在胰腺癌细胞和胰腺癌组织中低表达

利用RT-qPCR方法检测4种胰腺癌细胞AsPC1、PANC1、MP和SW1990中miR-122表达水平显示，胰腺导管上皮HPDE细胞比较，4种胰腺癌细胞miR-122表达水平均下降（均P < 0.01，图 1A）。同时，在20例胰腺癌临床样本中检测miR-122的表达量，RT-qPCR结果显示与癌旁组织比较，胰腺癌组织中miR-122表达水平降低（P < 0.01，图 1B）。

2.2 miR-122过表达抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力

将miR-122模拟类似物和阴性对照瞬转PANC1细胞后48 h，通过RT-qPCR检测两组细胞中miR-122表达量显示，与阴性对照组比较，转染miR-122模拟类似物后miR-122表达量增加（P < 0.01），提示miR-122成功转入PANC1细胞，可用于后续细胞功能研究（图 2A）。PANC1细胞成功瞬转培养24 h后，MTT实验提示过表达miR-122培养48、72和96 h后PANC1细胞增殖能力被抑制（均P < 0.01，图 2B）；伤口愈合实验结果显示过表达miR-122培养24 h后PANC1细胞迁移能力被抑制（均P < 0.01，图 2C）；transwell侵袭实验结果显示过表达miR-122培养24 h后PANC1细胞侵袭能力被抑制（P < 0.01，图 2D）。

3 讨论

肿瘤的发生和发展涉及多基因突变、多阶段和多因素过程。基因改变包括癌基因激活和抑癌基因失活，与癌基因激活比较，抑癌基因的失活在肿瘤发生与发展中起着更重要的作用。非编码RNA（尤其是miRNA）参与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等众多病理过程，因而受到学界越来越多的关注。miRNA是内源性单链小分子非编码RNA，成熟的miRNA具有调节基因表达活性的功能^[12]。miRNA作为一种重要的转录后调控因子，广泛参与肿瘤相关基因调控，在肿瘤的诊断和治疗方面扮演重要角色，为肿瘤研究提供新思路。

前期本研究组通过分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库芯片中胰腺癌与正常胰腺组织的差异表达miRNA谱，发现与正常胰腺组织比较，在胰腺癌组织中筛选出多个差异表达miRNA，其中miR-122在癌组织中表达下调并在国内未见相关报道；利用4种胰腺癌细胞和20例胰腺癌组织验证miR-122的表达量变化发现，miR-122在4种胰腺癌细胞中的表达水平较正常胰腺导管上皮细胞降低。同时在20例胰腺导管腺癌临床样本中检测miR-122的表达，亦发现癌组织比癌旁组织中的miR-122表达水平低，提示胰腺癌的发生和发展可能与miR-122的下调相关，提示miR-122在胰腺癌中可能扮演抑癌基因角色。这与之前研究报道的miR-122表达量结果一致^[13-15]。

进一步对miR-122在胰腺癌细胞中的生物学功能进行探讨，主要明确miR-122对胰腺癌的增殖、迁移和侵袭能力的作用。体外研究在PANC-1胰腺癌细胞中研究过表达miR-122后是否影响胰腺癌细胞的生物学功能，选择PANC-1细胞的原因在于前期检测胰腺癌细胞中的miR-122表达量时，发现在PANC-1细胞中miR-122表达水平最低。过表达PANC-1细胞中的miR-122表达水平后，能够抑制PANC-1细胞的增殖、迁移和侵袭的能力。这与之前miR-122在膀胱癌和乳腺癌中增殖、迁移和侵袭作用的报道结果一致^[16-17]。在胰腺癌中发现反链碘甲状腺素脱碘酶3（iodothyronine deiodinase 3 opposite strand，DIO3OS）可直接与miR-122结合并抑制其表达，而miR-122在胰腺癌细胞中起抑癌作用^[18]。miR-122-5p的过表达能够通过下调胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）中细胞周期蛋白G1（cell cyclin G1，CCNG1）的表达，起到抑制细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）^[19]。这些与本研究结果是一致的，提示miR-122-5p可能是PDAC的治疗靶点。

miRNA可通过与靶基因结合，进而对其靶基因表达实现负调控而发挥作用。因此，在miRNA的研究中，对miRNA靶基因的预测及验证在整个miRNA研究中起着非常重要的作用。本研究发现，胰腺癌中miR-122呈现低水平表达，同时过表达miR-122能够抑制胰腺癌细胞的生物学功能，包括增殖、迁移和侵袭能力。本研究组将进一步预测和验证miR-122抑制胰腺癌生物学功能的靶基因，同时体内研究miR-122对胰腺癌增殖和侵袭生物学功能的影响。