中国女性恶性肿瘤中乳腺癌发病率居前列，在病程早期即可发生转移，是导致许多女性早期死亡的恶性肿瘤^[1-2]。目前乳腺癌的治疗手段不断完善，但常发生转移导致治疗失败，患者生活质量下降甚至死亡，肿瘤转移后临床上仍然缺乏针对性的有效对策。利用分子标志物预测肿瘤患者转移的潜能，对制定有效的个体化治疗方案有决定性作用，同时对提高患者的生存率和生活质量也有重要意义。胶质细胞系源性神经营养因子受体α1（glial cell line derived neurotrophic factor α1，GFRα1）属于膜受体，与配体神经胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）结合后，在生理条件下的主要功能是促进神经元细胞的生长发育和迁移^[3]。GFRα1异常表达可影响肿瘤的生物学行为。在神经胶质细胞瘤、乳腺癌和胰腺癌等肿瘤中GFRα1表达升高^[4-6]，GFRα1高表达促进肿瘤细胞的侵袭迁移及扩散^[7-8]。深入研究表明，GFRα1与配体GDNF结合后，既可与RET原癌基因（RET proto-oncogene，RET）形成复合物，也可以通过与神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）结合，从而激活下游信号通路，在不同的细胞中，这2条通路可同时也可分别发挥作用^[9]。导致乳腺癌淋巴结转移的原因有多种。本研究将新疆医科大学附属肿瘤医院的原发乳腺癌组织按是否有淋巴结转移分为两组，通过免疫组织化学及Western blot检测两组乳腺癌组织中GFRα1、RET及NCAM的表达水平，探索GFRα1可能的下游通路与淋巴结转移之间的关系。

术中留取原发肿瘤组织标本，置于液氮中速冻后保存于-80℃冰箱中。将2016年6月1日至2019年6月1日冻存组织根据术后病理结果分为淋巴结转移和无淋巴结转移患者。纳入标准：（1）浸润性乳腺癌；（2）行腋窝Ⅰ和Ⅱ组淋巴结清扫；（3）患者知情同意并签署知情同意书；（4）临床资料完整。排除标准：（1）年龄 < 18岁；（2）合并其他恶性肿瘤；（3）乙肝表面抗原、丙型病毒性肝炎抗体或人免疫缺陷病毒抗体阳性；（4）妊娠期患者；（5）术前接受过化疗、放疗、内分泌治疗或免疫治疗；（6）男性乳腺癌；（7）特殊类型乳腺癌（炎性乳腺癌、派杰氏病、黏液癌、髓样癌和小管癌）。采用随机数字表法从淋巴结转移和无淋巴结转移患者中各抽取50例为淋巴结转移组和无淋巴结转移组，收集患者冻存标本及相应临床资料。所有手术患者术前均签署标本留取及用于科研用途同意书。本研究经本院伦理委员会审核通过。

淋巴结转移组年龄29~67岁，中位年龄48岁。无淋巴结转移组年龄31~65岁，中位年龄50岁。两组年龄、月经状态、体质量指数（body mass index，BMI）、病理类型、雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性率、孕激素受体（progesterone receptor，PR）阳性率及人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性率比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05，表 1）。

对石蜡包埋好的组织进行连续4 μm切片，使用免疫组织化学染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）和DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），一抗分别使用兔抗人GFRα1多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）、兔抗人RET多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）和兔抗人CD56多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），分别按1∶100、1∶200和1∶200稀释，每张切片滴加一抗50 μL，4℃过夜。室温复温20 min后洗涤、滴加辣根过氧化物酶标记的二抗50 μL，室温静置20 min。洗涤后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液50 μL，室温孵育20 min。

所有结果判读由2名 > 10年工作经验的病理科医师独立判读，若有结果不符则由第3名医师判定。光学显微镜下随机选取5个40倍视野，按照阳性细胞染色强度评分：阴性着色0分；淡黄色1分；浅褐色2分；深褐色3分。按照阳性细胞百分比评分：0% 0分；1%~25% 1分；26%~50% 2分；51%~75% 3分；76%~100% 4分。2项评分相乘后为总评分。

组织经液氮研磨之后加入含蛋白酶抑制剂（武汉博士德生物工程有限公司）和广谱磷酸酶抑制剂（武汉博士德生物工程有限公司）的可溶性蛋白RIPA裂解液（武汉博士德生物工程有限公司），充分混匀，4℃放置60 min后，12 000 r/min 4℃离心15 min收集上清。BCA法测定蛋白浓度，使用Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit（BCA；全式金）试剂盒，SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，漂洗后加入适量5×SDS-PAGE上样缓冲液（含β-巯基乙醇），100℃沸水加热处理5 min，使蛋白充分变性，12 000 r/min离心5 min，取上清备用。PVDF转膜；使用含5%脱脂奶粉的封闭液，封闭转印膜1 h，然后TBST洗3次，5 min/次。滴加一抗兔抗人GFRα1多克隆抗体（1∶200）、兔抗人RET多克隆抗体（1∶800）、兔抗人CD56多克隆抗体（1∶800）和兔抗ACTB多克隆抗体[生工生物工程（上海）股份有限公司，1∶1 000]4℃孵育过夜，加入山羊抗兔IgG H & L（HRP）（英国Abcam公司；GFRα1，1∶5 000；RET，1∶5 000；NCAM，1∶5 000；β-actin，1∶15 000），显色并用Chemiscope 3000化学发光成像仪系统（上海勤翔科学仪器有限公司）检测并拍照。

使用SPSS 17.0统计学软件分析数据。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较若符合正态分布采用t检验，不符合正态分布使用秩和检验。计数资料以频数（百分比）表示，组间比较采用χ²检验或Fisher精确检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

免疫组织化学检查显示，淋巴结转移组和无淋巴结转移组的GFRα1表达比较，差异具有统计学意义[（4.0±1.8） vs （2.4±1.9）；Z=-3.492，P < 0.01]。两组RET表达比较，差异具有统计学意义[（3.9±1.8） vs （2.4±1.6）；Z=-3.979，P < 0.01]。两组NCAM表达比较，差异无统计学意义[（3.7±1.1） vs （4.3±2.1）；Z=-1.163，P=0.245；图 1]。

图 1 淋巴结转移组及无淋巴结转移组的GFRα1、NCAM和RET免疫组织化学检查结果（SP×400） Fig.1 Immunohistochemical results of GFRα1, NCAM and RET in the lymph node metastasis group and no lymph node metastasis group (SP×400)

图选项

Western blot结果显示，淋巴结转移组和无淋巴结转移组GFRα1蛋白表达水平比较，差异具有统计学意义[（0.679±0.044） vs （0.495±0.064）；Z=-4.739，P=0.003]。两组RET蛋白表达水平比较，差异具有统计学意义[（0.510±0.018） vs （0.291±0.035）；Z=-11.128，P < 0.01]。两组NCAM蛋白表达水平比较，差异无统计学意义[（0.574±0.078） vs （0.483±0.107）；Z=0.636，P=0.217；图 2]。

注  A：Western blot检测乳腺癌组织中GFRα1、RET和NCAM蛋白的表达；B：乳腺癌组织中GFRα1、RET和NCAM蛋白表达水平柱状图；*P < 0.05；1:淋巴结转移组；2：无淋巴结转移组 图 2 淋巴结转移组及无淋巴结转移组中GFRα1、NCAM和RET的Western blot检测结果 Fig.2 Western blot results of GFRα1, NCAM, and RET in the lymph node metastasis group and no lymph node metastasis group

图选项

GDNF的受体GFRα家族有GFRα1、GFRα2、GFRα3和GFRα4^[10]，GDNF与GFRα1的结合力远高于其他分子，GFRα1与配体GDNF结合后，可与原癌基因RET形成复合物GDNF-GFRα1-RET，活化其胞内酪氨酸激酶区域的活性，继而激活PI3K/Akt、JNK、RAS/ERK及MAPK等信号通路，以维持神经元细胞的正常生长发育^[11]；另一方面，GFRα1也可经非依赖RET的途径发挥作用，NCAM的第3个免疫球蛋白区域能与GDNF结合，在正常情况下，NCAM与GDNF是低亲和力结合的，只有在GFRα1存在条件下，才能与GDNF高亲和力结合且激活GDNF相关信号通路。NCAM的第4个免疫球蛋白域是与GFRα1结合的区域。通过与神经细胞黏附分子NCAM结合，形成复合物GDNF-GFRα1-NCAM激活下游Fyn激酶，参与细胞的粘附、神经元及突触的形成等过程^[12]；同时也能够激活ERK1/2信号通路，与维持细胞的分化和增殖相关^[13]。

研究发现，在乳腺癌组织中GFRα1的表达量增加，增高的GFRα1表达量与乳腺癌淋巴结转移及更高的临床分期有关^[14]。乳腺癌淋巴结转移可能与GFRα1基因甲基化有关^[15]。体内外模型中发现炎性细胞因子TNF-α和IL-1β可以通过多种方式活化GDNF-GFRα1-RET通路从而促进乳腺癌的进展^[16]。GDNF能促进GFRα1及RET阳性表达的乳腺癌细胞集落的发散，而GFRα1-RET能增强乳腺癌细胞的运动能力^[17], 近期有研究揭示RET通路在乳腺癌的发生和发展中的潜在作用，靶向RET通路在未来可能成为乳腺癌的治疗方法之一^[18]。

通过免疫组织化学染色观察发现，GFRα1、RET和NCAM在乳腺癌组织中均有一定程度的着色；与无淋巴结转移组比较，淋巴结转移组中GFRα1和RET的表达增强，一定程度上说明肿瘤进展和淋巴结转移可能与GFRα1和RET的表达增强有关，可能是GDNF-GFRα1-RET通路的激活促进乳腺癌淋巴结转移。Western blot检测发现相似结果，与无淋巴结转移组比较，淋巴结转移组中GFRα1和RET蛋白表达量增加，再次佐证GDNF-GFRα1-RET通路激活和数量增加的可能。而无论免疫组织化学还是Western blot检测结果都观察到NCAM虽然有一定程度的表达，但两组之间比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05），GDNF-GFRα1-NCAM通路在乳腺癌淋巴结转移的发生和发展过程中可能没有发挥关键作用，其在乳腺癌中扮演的角色仍需进一步探索。GFRα1和RET在淋巴结转移乳腺癌患者的原发灶组织中的表达高于无淋巴结转移组，这可能与GDNF-GFRα1-RET通路的激活有关。