肝细胞癌是全世界常见的六大恶性肿瘤之一，病死率排第4位^[1]。肝细胞癌发生和发展与肿瘤细胞增殖和凋亡密切相关。目前已有研究证实，鼠双微体2（murine double minute 2，MDM2）-p53通路及白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、转化生长因子α（transforming growth factor α，TGFα)、转录因子NF-κβ和裂解刺激因子亚单位2（cleavage stimulation factor subunit 2，CSTF2）基因均参与肝癌的发生和发展^[2-4]。除此之外，肿瘤血管形成在肿瘤发生和发展中扮演重要角色。肝癌是血管增生性肿瘤，其肿瘤血管丰富^[5-6]。血管内皮生长因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）是正常血管形成及肿瘤微血管形成的关键基因，在多种肿瘤中高表达^[7]。而缺氧微环境是实体肿瘤中的常见现象，其与肿瘤细胞的血管形成密切相关。缺氧环境下，缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）表达增加，可调控VEGF表达影响肿瘤血管形成^[8]。前期研究发现，Pokemon在肝癌组织中高表达，经丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（protein kinase B，AKT）/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK)信号通路促进肝癌细胞增殖并经死亡受体介导的凋亡途径（Fas-FADD-caspase8途径）和线粒体途径介导的细胞凋亡通路抑制肝癌细胞的凋亡^[9-10]。然而针对Pokemon对肝细胞癌血管形成的作用的相关研究甚少。本研究探讨Pokemon在缺氧条件下对肝细胞癌血管形成的影响。

1 材料与方法 1.1 细胞株及主要试剂和仪器设备

人肝细胞癌细胞株HepG2购自美国ATCC。人肝细胞癌细胞株Huh7及人宫颈癌细胞株Hela购自中国科学院上海细胞库。TRIzol和一步法RNA反转录试剂盒购自美国Invitrogen公司。脂质体2000转染试剂、胎牛血清、100×双抗、DMEM和RPMI-1640培养液均购自美国Gibco公司。荧光定量PCR仪（ABI prism7500）和PCR仪（Gene Amp2700）均购自美国Applied Biosystems公司。蛋白电泳仪和蛋白转移装置均购自美国Biorad公司。核酸蛋白检测仪购自德国Eppendorf公司。Pokemon抗体和GAPDH抗体购自英国Abcam公司。HIF1α抗体和VEGFR抗体购自美国CST公司。

1.2 细胞培养

HepG2细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养液进行培养。Huh7细胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液。两者均为贴壁生长型的细胞。将细胞接种于无菌培养皿内，并放置于37℃、5%CO₂、100%湿度的细胞培养箱中培养。

1.3 构建细胞培养缺氧微环境

缺氧产气袋AnaeroPack及配套2.5 L密封容器购自日本三菱公司，其基本原理是将密闭空间中的氧气完全吸收掉，然后产生二氧化碳，开发出完全厌氧培养环境（AneroPack-Anaero，30 min反应后氧气浓度降为0）。将培养皿放入装有厌氧产气袋的密闭容器，构建缺氧的培养环境，再放入细胞培养箱中培养。

1.4 实时荧光定量PCR检测

实验所用引物由北京华大基因有限公司合成（引物序列见表 1）。采用SYBR Green Ⅰ试剂进行检测；收获HepG2和Huh7细胞后，提取细胞总RNA，反转录为cDNA；循环参数：95℃ 5 min，94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 40 s；共40个循环，最后72℃ 10 min。

1.5 Western blot检测

RIPA裂解液提取细胞总蛋白，Bradford法检测蛋白浓度，采用恒压电泳及恒流电转将蛋白转移至PVDF膜上，用5%无脂奶粉封闭PVDF膜，孵育一抗（抗体按1∶1 000稀释于BSA液中，加入抗体水平摇床4℃孵育过夜），次日用TBS（含0.1%Tween20）洗涤PVDF膜3次（水平摇床，每次洗膜10 min）；孵育二抗（将膜浸泡于按1∶5 000稀释的二抗中，室温下水平摇床缓慢摇动孵育1 h），用TBS洗涤PVDF膜3次（水平摇床，每次洗膜10 min），最后使用ECL法显影。

1.6 靶向Pokemon基因干扰质粒构建及验证

运用RNA干扰技术（RNAi），成功构建靶向Pokemon基因的siRNA重组质粒psiRNA。psiRNA上游引物：5'-CACCAGTAGAATGTGTACGGGATACGTGTGCTGTCCGTATCTCGTCACGTTCTGCTTTTTT-3'，下游引物：5'-GCATAAAAAGCAGAACGTGTACGAGATACGGACAGCACACGTATCCCGTACACATTCTACT-3'。将干扰质粒psiRNA和PU6空载质粒分别稳定转染HepG2和Huh7细胞，利用嘌呤霉素筛选出稳转细胞株HepG2 si-Pokemon、HepG2-PU6（对照）、Huh7 si-Pokemon和Huh7-PU6（对照），并在蛋白水平验证Pokemon的干扰效果。

1.7 构建过表达HIF-1α的Hela细胞

培养HeLa细胞密度约占培养板的80%，进行转染，转染前1 d细胞换新的培养液；用250 μL无血清培养液稀释HIF-1α质粒（0、5、10和15 μg），轻轻混匀；用无血清培养液稀释Lipofectamine^Ⓡ 2000（0、12.5、25和37.5 μL）至250 μL，轻轻混匀，室温孵育5 min；将质粒稀释液和转染试剂稀释液混匀，室温孵育20 min；将复合物加入培养板中，放入37℃ CO₂培养箱孵育36 h，最后用Western blot验证。

1.8 统计学分析

采用Graphpad Prism软件进行数据分析。组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 肝细胞癌细胞Pokemon的表达及沉默效果验证

HepG2和Huh7细胞中Pokemon均高表达（图 1）。采用RNA沉默技术构建稳定沉默Pokemon基因的稳转细胞株（HepG2 si-Pokemon和Huh7 si-Pokemon）。Western-blot法显示，HepG2 si-Pokemon和Huh7 si-Pokemon细胞株中Pokemon表达受到抑制（均P < 0.05，图 1）。

2.2 Pokemon基因沉默抑制肝细胞癌细胞血管形成相关基因的表达

RT-PCR检测显示，与HepG2-PU6细胞比较，HepG2 si-Pokemon细胞中血管形成相关基因（ANG2、VEGFA和VEGFR2）的表达受到抑制，差异均具有统计学意义（均P < 0.05）。与Huh7-PU6细胞比较，Huh7 si-Pokemon细胞中ANG2、VEGFA和VEGFR2基因的表达也受到抑制（均P < 0.05，图 2）。

2.3 缺氧条件下肝细胞癌细胞Pokemon基因沉默抑制HIF-1α表达

Western blot法检测显示，缺氧条件下，HepG2 si-Pokemon细胞培养2、4和6 h后，HIF-1α的表达均较HepG2-PU6细胞减少（P < 0.05，图 3）。缺氧条件下，Huh7 si-Pokemon细胞培养6 h后，HIF-1α的表达较Huh7-PU6细胞减少（P < 0.05）。

而在Hela细胞中采用0、5、10和15 μg HIF-1α质粒瞬转36 h后，Western blot检测发现，随着HIF-1α的表达增加，Pokemon蛋白的表达变化差异无统计学意义（P > 0.05，图 4）。缺氧条件下，沉默Pokemon基因可抑制HIF-1α的表达，而过表达HIF-1α并不能调控Pokemon的表达。

3 讨论

Pokemon是具有原癌基因活性的转录抑制因子，是POZ and Kruppel（POK）家族中的成员之一，其包括C末端的Kruppel型结构域和N末端的POZ/BTB结构域。N末端结构域可为蛋白招募联合抑制因子，从而起到转录抑制作用。Pokemon基因与多种肿瘤如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌和甲状腺肿瘤的发生和发展密切相关^[11-14]。研究发现，Pokemon通过多种分子机制促进肿瘤发生和发展：（1）Pokemon可抑制ARF的转录活性，从而激活MDM2，进一步抑制下游靶基因p53的表达，导致肿瘤发生^[15]；（2）Pokemon可抑制阻滞细胞周期的关键因子p21，调控细胞周期，促进肿瘤的发生和发展^[16]；（3）Pokemon促进NF-κB入核及定位，并促进NF-κB应答基因E-selectin的转录活性，从而导致肿瘤的发生^[17]。而在肝细胞癌中，目前已有研究证实，原癌基因Pokemon可通过促进肝癌细胞的增殖及抑制其凋亡参与肿瘤发生和发展^[9-10]。但是Pokemon对肿瘤细胞血管形成相关方面的机制研究较少，而本实验结果显示，Pokemon在肝细胞癌血管形成中起着关键性作用。

肝癌细胞代谢旺盛，需要依赖肿瘤新生血管来供给营养，因此肿瘤血管形成在肝癌细胞中增殖、侵袭和转移中起着至关重要的作用^[18]。促血管生成因子VEGF和VEGFR在肝细胞癌血管形成中起着关键性的作用^{[6, 19]}。肿瘤缺氧微环境是固体肿瘤中常见现象，也常见于肝细胞癌中^[20]。其可诱导HIF-1α的形成。HIF-1α作为低氧适应性介导者，可活化血管形成信号通路的相关基因包括VEGF和VEGFR^[21]。在肝癌中血管形成相关基因ANG2、VEGFA和VEGFR2是高表达的^[22-23]，也有临床研究显示，VEGF与肝癌进展及临床预后差高度相关^{[21, 24]}。本研究显示，在抑制Pokemon基因的表达后，血管形成相关基因的表达均受到抑制，说明Pokemon基因与肝癌细胞血管形成正相关。为了研究其调控的相关分子机制，本研究模拟了肝癌细胞生存的缺氧微环境，证实了Pokemon可调控HIF-1α的表达。在肝癌细胞中，Pokemon可能通过上调HIF-1α的表达而促进肝癌细胞的血管形成。

综上所述，Pokemon不仅参与肝癌细胞增殖和凋亡过程。本研究也证实，Pokemon可参与肝癌细胞血管形成。目前肝癌的治疗主要有手术、射频消融、介入靶向和免疫疗法^[25-26]，结合本研究结果，Pokemon基因有望成为肝细胞癌的生物学标志物及治疗的有效靶点，对肝细胞癌的诊断、疗效预测及预后起关键性作用。