胰腺癌为临床常见的恶性肿瘤，患者症状以腹痛、黄疸和消瘦为主，触诊可见腹部包块。发病后，及早确诊并给予治疗，有助于延长患者的寿命^[1]。胰腺癌中存在肿瘤内的异质性，受其影响，患者疾病治疗的临床效果往往存在较大的差异，且部分患者可发生耐药问题^[2]。而yes相关蛋白1（yes-associated protein 1, YAP1）蛋白表达，则与胰腺癌肿瘤异质性相关。为提高疾病的检出率，实现胰腺癌的个体化治疗，改善患者的预后，本研究于贵州省人民医院2017年9月至2018年9月收治的胰腺癌患者中，随机选取100例作为观察组，并选取健康组织作为对照组，对YAP1蛋白表达与胰腺癌肿瘤异质性的关系进行分析。

1 资料与方法 1.1 一般资料

以贵州省人民医院收治的胰腺癌患者100例作为观察组，根据肿瘤标本选取区域的不同，将其分为A、B、C和D组。其中，男性60例，女性40例；年龄32~78岁，（56.39±4.15）岁；T1期35例，T2期20例，T3期25例，T4期20例；肿瘤直径（5.26±0.15）cm。选取观察组患者对应癌旁胰腺组织100例作为对照组。

纳入标准：（1）所有患者均病理确诊为胰腺癌（导管腺癌）^[3]；（2）患者术前未行任何治疗；（3）患者无其他系统重大疾病；（4）无意识与精神异常；（5）无胰腺手术史；（6）患者自愿参与研究。本研究已由贵州省人民医院伦理委员会审批通过。

1.2 方法 1.2.1 分组及取材方法

胰腺癌根治术中，于肿瘤4个区域取材，记作A、B、C和D区域，D位于肿瘤表面，自肿瘤表面向内取材，A、B、C和D间隔均为1 cm，A接近肿瘤中心区。此外，于癌旁胰腺组织中取材作为对照组标本。取材后，应将标本置于-80℃环境下保存，待用。

1.2.2 病理检查与分期方法

选取肿瘤标本，采用4%甲醛固定，对标本进行脱水、浸蜡、包埋及切片处理。采用HE苏木精伊红染色，显示肿瘤基本结构及细胞成分。采用染色的方式，显示基底膜和网状纤维，观察并记录检查结果，对胰腺癌进行诊断。根据病理检查结果，明确患者的病理分期情况，共包括T1（含T1a、T1b和T1c）、T2、T3和T4期。其中，T1期为肿瘤直径≤2 cm；T2期为肿瘤直径2.1~4.0 cm；T3期为肿瘤直径 > 4 cm；T4期为不论肿瘤大小，侵犯腹腔干及肠系膜上动脉和（或）肝总动脉。

1.2.3 试剂准备

PV-9000免疫组织化学试剂盒和Anti-YAP1单抗购自欣博盛生物科技有限公司。

1.2.4 组织芯片制备

选取肿瘤标本，常规石蜡包埋。对样本进行切片以及HE染色，显微镜下阅片，相应组织点于蜡块上标记。采用穿刺针将供体蜡块转移至受体蜡块上，制作组织微阵列。将切片厚度控制在4 μm，准备进行组织微阵列免疫组织化学检查。

1.2.5 组织微阵列免疫组织化学检查

将组织芯片置于68℃烤箱中2 h，采用二甲苯脱蜡，采用100%、85%及75%梯度乙醇水化。选取磷酸盐缓冲液，对标本进行洗涤，并采用3%H₂O₂封闭内源性过氧化氢酶15 min，取0.1%枸橼酸钠溶液，给予修复20 min，4℃孵育。第2天，采用PBS洗片，加PV-9000试剂，加一抗（浓度1∶100），37℃下孵育20 min及30 min。苏木精对比染色，氨水反蓝。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性胶封固，晒干，扫片。

1.3 观察指标

观察胰腺癌组织YAP1蛋白表达情况。分析YAP1蛋白表达与胰腺癌肿瘤临床病理特征和肿瘤内异质性的关系。

1.4 结果判定依据

阳性细胞染色强度：无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。阳性细胞比例：无为0分，≤25%为1分，> 25%~75%为3分，> 75%为4分。将上述2项结果相乘，根据肿瘤微阵列位点中最大乘积，定义YAP1蛋白表达。0为（-），1~4为（+），5~8为（++），9~12为（+++）。

1.5 统计学分析

采用SPSS 21.0软件处理数据。计数资料采用频数（百分比）表示，组间比较采用χ²检验。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 胰腺癌组织YAP1蛋白表达情况

观察组和对照组YAP1蛋白表达阳性率为80.0%（80/100）和0.0%（0/100），差异具有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 YAP1蛋白表达与胰腺癌肿瘤分期的关系

100例患者中，T1、T2、T3和T4期患者YAP1蛋白表达阳性率分别为82.9%（29/35)、80.0%(16/20)、76.0%(19/25)和75.0%（15/20），差异无统计学意义（P > 0.05，图 1）。

2.3 YAP1蛋白表达与胰腺癌瘤内异质性的关系

观察组80例YAP1蛋白表达阳性患者A、B、C和D各区域YAP1蛋白表达阳性率分别为25.0%（20/80）、16.3%（13/80）、8.8%（7/80）和50.0%（40/80），差异具有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

胰腺癌为临床常见的消化系统恶性肿瘤，发病与生活、环境和遗传因素相关。长期吸烟饮酒、高脂肪类食物的长期摄入、环境污染和家属存在胰腺癌病史者罹患该疾病的风险更高^[4]。胰腺癌患者以男性居多。发病后及早确诊并给予治疗，可有效改善患者的预后。

肿瘤异质性包括瘤间异质性和瘤内异质性。本文所研究的肿瘤异质性为后者。瘤内异质性指肿瘤细胞以内基因与表型不同的情况。临床研究发现，肿瘤异质性的形成与遗传和环境因素的相互作用有关，受遗传不稳定性的影响较大。通常情况下，肿瘤的发生仅涉及体细胞，而不涉及性细胞^[5]。因此，多数肿瘤均不具有遗传性，但如存在种系基因缺陷，肿瘤则可表现出遗传性^[6]。

肿瘤异质性是干扰临床活检以及肿瘤标志物预测的主要因素，是导致相同病情患者采取同种方法治疗但疗效和对药物敏感性却有差异的主要原因^[7-10]。为提高疾病检出率和改善治疗效果，对胰腺癌肿瘤异质性进行分析较为重要^[11-13]。本研究发现，胰腺癌组织中YAP1蛋白表达升高，不同病理分期的胰腺癌患者YAP1蛋白阳性率比较，差异无统计学意义（P > 0.05），来源于不同区域的肿瘤标本YAP1蛋白阳性率比较，差异具有统计学意义（P < 0.05）。胰腺癌中心区不存在淋巴管，而肿瘤表面与周边区域可见淋巴管数量增多现象，判断可能与肿瘤浸润生长有关。因此，于该区域取材，YAP1蛋白阳性率更高。因胰腺肿瘤具有瘤内异质性，不同区域的YAP1蛋白表达阳性率存在差异，即使于YAP1蛋白阳性率最高的胰腺肿瘤表面取材，同样存在漏诊的风险，故应选择多个点位标本进行病理诊断，达到提高疾病检出率的目的^[14-15]。