胃癌是常见的恶性肿瘤之一。2018年全球癌症数据统计显示，全球胃癌死亡率居所有恶性肿瘤第3位^[1-2]。随着医疗水平的提高，近年来胃癌发病率出现下降趋势，且平均发病年龄出现后移趋势，但胃癌转移仍是导致胃癌患者死亡的重要原因^[3-5]，因此寻找影响胃癌增殖和迁移的相关基因，对于胃癌诊断、有效治疗及准确判断预后具有重要意义。

富含脯氨酸小蛋白2A（small prolin-rich proteins 2A，SPRR2A）是在表皮分化复杂区域中编码的10个SPRR基因家族中的成员之一。SPRR基因家族编码一类与细胞分化相关的蛋白^[6]，和其他分化相关基因（involucrin、loricrin和late envelope proteins）共同构成表皮分化复合物（epidermal differentiation complex, EDC），影响细胞分化^[7-8]。SPRR2A在胃癌细胞中的研究尚未见报道，本研究前期基因芯片结果显示，SPRR2A在胃癌组织中的表达增加，与癌旁正常胃黏膜组织比较表达差异高达12倍，表明SPRR2A可能在胃癌的发展中起重要作用。因此，本研究拟通过检测SPRR2A在胃癌细胞中的表达以及转染靶向SPRR2A的RNAi质粒和SPRR2A表达质粒后检测SPRR2A的表达情况，探讨SPRR2A对胃癌细胞增殖和迁移的影响。

1 材料与方法 1.1 实验材料及仪器

胃癌细胞株SGC-7901、MKN-28和BGC-823以及胃上皮细胞株GES-1来自中科院上海富恒细胞库。pcDNA3.1、ex-SPRR2A-pcDNA3.1质粒、干扰RNA（si-SPRR2A）和对照干扰RNA（si-NC）均购自上海吉满生物科技有限公司。DMEM培养液、RPMI-1640培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司。体外转染试剂盒购自美国jetPRIME公司。总蛋白提取试剂盒购自北京碧云天生物技术有限公司。β-actin抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。CCK8检测试剂盒购自北京金克隆生物公司，Trizol试剂购自北京Bioteke生物技术有限公司。qRT-PCR SYBR Green PCR试剂购自南京Vazyme生物公司。Transwell小室购自美国Corning公司。ABI 7500实时荧光定量PCR仪购自美国应用生物系统公司。Image Quant LAS4000 mini化学发光成像仪购自美国通用电气医疗集团。FLx800荧光发光酶联仪购自北京Biotek公司。

1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养

胃癌细胞株SGC-7901和MKN-28用含10% 胎牛血清的DMEM培养液培养，胃癌细胞株BGC-823和永生化胃上皮细胞株GES-1用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，所有细胞均置于37℃ 5%CO₂培养箱中培养，细胞生长至80%~90%时，按1∶2传代培养。

1.2.2 实时定量PCR

Trizol法提取细胞总RNA，微量核酸蛋白测定仪检测RNA的浓度和纯度，制备引物终浓度为2 μmol/L的RNA 20 μL反应体系。ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行反转录和PCR。反应参数：50℃3 min；95℃5 min；95℃10 s，60℃30 s，40个循环。GAPDH数据为内参，SPRR2A mRNA相对表达量用2^-ΔΔCt表示。SPRR2A上游引物为5’- AGTCAAAGTATCCACCGAAGAGC-3’，下游引物为5’- AGGGATCATCATGGGCAGATTACTG-3’。GAPDH上游引物为5’- AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物为5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。

1.2.3 Western blot法

提取各类细胞的总蛋白，二奎啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法定量检测。采用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)预制胶进行电泳分离并转至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用新鲜配制的10%脱脂奶粉/TBST（TRIS-HCL 200 mmol/L、氯化钠9%或1.5 mol/L和Tween20组成）摇床上封闭1 h，加入SPRR2A抗体（美国Abcam公司）及抗β-actin抗体，4℃反应过夜。TBST液洗涤3次，每次15 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，用TBST液进行3次洗涤，每次15 min，最后用化学发光法检测，结果用灰度值表示。

1.2.4 细胞转染

胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823，细胞数量达到80%后，换成不含胎牛血清的DMEM培养液进行转染。实验分为未转染任何质粒的空白对照组、ex-SPRR2A-pcDNA3.1质粒转染组(ex-SPRR2A组)和pCDNA3.1的空载质粒转染组(空载质粒组)，SPRR2A靶向siRNA干扰组(si-SPRR2A组) 及对照干扰RNA组(si-NC组)。参照DNA & siRNA体外转染试剂盒操作说明，将对照组(si-NC组或空载质粒组)、转染组(ex-SPRR2A组或si-SPRR2A组)分别转染至胃癌细胞中。转染6 h后更换为10%胎牛血清的培养液中继续培养36 h。实验重复≥3次。

1.2.5 细胞增殖和毒性检测（cell counting kit-8，CCK-8）实验

SGC-7901和BGC-823细胞转染24 h后，胰酶消化后重悬计数，按1×10³细胞/mL分别接种100 μL至96孔板，每组6个复孔。分别培养24 h、48 h、72 h和96 h，加入CCK-8试剂10 μL，37℃培养箱培养2 h后检测450 nm处吸光度。实验重复3次。

1.2.6 实时无标记细胞分析技术（real time cellular analysis，RTCA）法检测细胞增殖能力

将各组细胞计数后接种于RTCA系统的E-Plate 16板各孔中，每组平行4个复孔，加入50 μL培养液，将E-Plate 16放入仪器中，完成1 min的稳定性检测。37℃5%CO₂培养箱中培养48 h，观察细胞增殖曲线。

1.2.7 Transwell实验

用胰酶消化收集各转染组细胞，加入无血清培养液制成细胞悬液，计数，按2×10⁴细胞/孔的浓度接种水化后的transwell小室，每孔约100 μL, 每组平行3个复孔。先在下室中加入500 μL含10%胎牛血清的培养液，然后放入transwell小室，静置5 min让膜充分湿润；放入培养箱中培养24 h，取出小室，在磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)溶液中放置5 s，冲洗3次，用棉签拭去上室内多余的细胞，正反各转动约5次，用95%甲醇固定15 min，0.1%结晶紫染色20 min，用PBS冲洗。最后均移至显微镜（×200）下拍照，计随机3个视野内细胞数量。实验重复3次。挑选3个视野拍照计数。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 SPRR2A在胃癌细胞株中的表达情况

通过实时荧光定量PCR和Western blot法观察不同分化胃癌细胞株和正常胃黏膜细胞中SPRR2A的表达水平。RT-PCR法检测胃癌细胞BGC-823、MKN-28和SGC-7901以及正常胃黏膜GES-1细胞中SPRR2A的相对表达量分别为（849.22±0.04）、（77.17± 0.26）、（1.73±0.07）和（1.05±0.06）。胃癌细胞中SPRR2A的相对表达量均高于GES-1细胞（均P < 0.05）。Western blot结果显示，SPRR2A在BGC-832细胞中高表达，在SGC-7901细胞中低表达（图 1），胃癌细胞中SPRR2A表达均高于胃上皮细胞GES-1（均P < 0.05）。因此，本研究选取BGC-832和SCG-7901细胞用于后续研究。

2.2 构建SPRR2A表达/si-RNA干扰的胃癌细胞株

建立过表达SPRR2A质粒转染组(ex-SPRR2A组)和pCDNA3.1空载体组（空载质粒组）的SGC-7901细胞株。转染36 h后，Western blot法检测ex-SPRR2A组、空载质粒组和空白对照组中SPRR2A表达水平，ex-SPRR2A组中SPRR2A的表达水平高于空载质粒组和空白对照组（均P < 0.05，图 2A）。

通过RNA干扰法建立SPRR2A siRNA（si-SPRR2A组）及对照干扰（si-NC组）的BGC-823细胞株。转染36 h后，用Western blot法检测si-SPRR2A组、si-NC组和空白对照组中SPRR2A表达水平，与si-NC组和空白对照组比较，si-SPRR2A组中SPRR2A的表达水平降低（均P < 0.05），表明SPRR2A表达受到抑制（图 2B）。

2.3 SPRR2A对胃癌细胞增殖能力的影响

通过RTCA和CCK8实验绘制表达/沉默干扰SPRR2A转染后的胃癌细胞增殖曲线。CCK8实验结果显示，转染ex-SPRR2A后培养48 h、72 h和96 h时，SGC-7901细胞数量较空白对照组和空载质粒组均增多（均P < 0.05）；RTCA结果显示，转染后48 h内，ex-SPRR2A组SGC-7901细胞数量较空白对照组和空载质粒组增多（图 3）。与空白对照组和si-NC组比较，BGC-823细胞转染si-SPRR2A后培养48 h、72 h和96 h，细胞增殖指数均下降（均P < 0.05）；RTCA结果显示，在24 h内，转染si-SPRR2A的BGC-823细胞数量较空白对照组和si-NC组降低（图 3）。

2.4 SPRR2A对胃癌细胞迁移能力的影响

Transwell细胞迁移实验结果表明，ex-SPRR2A组SGC-7901细胞迁移数为（102.33±23.89）个，与空白对照组的（50.20±12.34）个和空载质粒组（62.46±19.33）个细胞比较，ex-SPRR2A组细胞迁移能力均增强（均P < 0.05）。si-NC组BGC-823细胞迁移细胞数量为（32.03±1.87）个，si-SPRR2A组细胞迁移数量为（16.81±2.28）个，与空白对照组的（40.01±3.46）个比较，si-SPRR2A组细胞迁移能力下降（P < 0.05，图 4）。

3 讨论

SPRR家族广泛存在于机体不同组织器官的上皮及屏障系统中，通过cDNA微阵列实验分析表明，SPRR2A在胃肠道、前列腺、结肠和乳腺组织中差异性高表达^[9-12]。在慢性鼻窦炎中，SPRR通过活性氧干扰细胞迁移，影响组织修复及伤口愈合^[13]。关于SPRR2A在肿瘤中的研究较少，主要集中在舌鳞状细胞癌和胆管细胞癌的研究中。SPRR2A在舌鳞状细胞中低表达，诱导过表达SPRR2A可以轻微的增加细胞增殖，但减少舌鳞状癌细胞的远处转移^[14]。在胆管细胞癌中过表达SPRR2A可增强肿瘤的局部浸润性，阻止肿瘤的远处转移^[15]。SPRR2在人乳头瘤病毒8型(human paplloma viruses 8, HPV8)转基因小鼠的鳞状细胞乳头状瘤形成期间表达增强，而在口腔鳞状细胞癌中呈低表达^[16-17]。SPRR2A在肿瘤中发挥着重要作用。

为了检测SPRR2A对于胃癌细胞增殖和迁移能力的影响，本研究选取不同分化能力的人胃癌细胞株(SGC-7901、MKN-28和BGC-823)和正常的人胃黏膜上皮细胞(GES-1)，通过实时荧光定量PCR和Western blot法检测各细胞株中SPRR2A表达情况。与人胃黏膜上皮细胞GES-1比较，SPRR2A在BGC-832细胞中高表达，在SGC-7901细胞中低表达，因此选用BGC-832和SCG-7901细胞转染靶向SPRR2A的siRNA片段或表达质粒以构建沉默或过表达SPRR2A的胃癌细胞株。通过RTCA和CCK-8细胞增殖实验和细胞迁移实验检测SPRR2A对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。结果显示，沉默SPRR2A后的BGC-823细胞增殖和迁移能力降低，而上调SPRR2A表达的SCG-7901细胞增殖和迁移能力增加，因此推测SPRR2A基因在胃癌细胞的增殖和迁移过程中起重要作用。有研究显示，在胃硬癌细胞株OCUM-2M中发现SPRR2A表达下调可促进OCUM-2M胃癌细胞株的侵袭和迁移^[18]，这与本研究结果相反，这可能与实验选取的胃癌细胞组织来源不同有关。胃硬癌为一种低分化癌伴有间质增生及广泛弥漫性浸润，可以找到印戒细胞。而本研究选取的胃癌细胞株为不同分化的普通型腺癌，间质内无显著的增生。这说明在SPRR2A基因表达量不同的胃癌细胞株中，SPRR2A基因所起到的作用具有一定的差异。

本研究结果显示，沉默或过表达SPRR2A可以影响胃癌细胞的增殖和迁移能力。现有的一些研究认为，SPRR2A促进细胞的迁移与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)有关。EMT使肿瘤细胞获得迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型，与肿瘤迁移和侵袭密切相关, 提示着预后不良^[19]。在人胆管上皮细胞中，过表达SPRR2A可改变胆管上皮细胞形态，向梭形间质细胞转变，并促进细胞迁移^[20]。在胆管癌细胞中，过表达SPRR2A导致细胞侵袭性增加，但无法形成转移灶，SPRR2A促进上皮间质转化这一过程，主要与信号传导与转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription，STAT3)激活酪氨酸激酶受体家族成员-表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)和酪氨酸激酶受体2(erb-b2 receptor tyrosine-protein kinase 2，ErbB2)以及上调糖蛋白130 (glycoprotein 130，gp130)有关^[21]。目前关于SPRR2A在胃癌中作用具体机制研究很少，笔者推测SPRR2A在胃癌的发生过程中可能通过促进癌组织细胞周围EMT形成，进而促进胃癌细胞的转移和浸润，其具体机制有待进一步验证。

综上所述，SPRR2A能够影响胃癌细胞的增殖及迁移，但具体调控的基因和分子机制尚不清楚。本文初步探讨SPRR2A与胃癌增殖和转移的关系，将有望作为临床上治疗胃癌的新靶点及生物标志物。