肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）占80%~85%，而肺腺癌作为NSCLC的主要亚型，发病率逐年攀升，5年生存率 < 20%^[1-2]。肿瘤免疫逃逸是肺腺癌治疗耐药和预后不良的核心原因，其中程序性死亡受体配体1[programmed death-ligand 1, PD-L1；又名cluster of differentiation 274（CD274）]通过与T细胞表面程序性死亡受体1（programmed death-1, PD-1）结合抑制免疫活性，是免疫逃逸的关键分子^[3-4]。尽管PD-L1抑制剂已成为肺腺癌一线治疗方案，但仅30%的患者响应，且耐药机制尚未完全明确^[5-6]，因此解析PD-L1的调控机制对优化免疫治疗至关重要。

PD-L1的表达受转录、转录后和翻译后多层面调控，其中RNA结合蛋白（RNA-binding protein, RBP）介导的转录后调控因具有细胞特异性和动态性成为近年研究热点^[7-8]。Ras-GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白1（Ras-GTPase-activating protein SH3 domain-binding protein 1, G3BP1）作为核心RBP，通过调控mRNA稳定性和介导应激颗粒形成参与肿瘤增殖、转移和耐药^[9-10]。近年研究显示，G3BP1在多种癌症中高表达并与不良预后相关：在膀胱癌中，G3BP1与SLU7形成复合物通过PI3K/Akt通路下调主要组织相容性复合体Ⅰ类分子（major histocompatibility complex Ⅰ, MHC-Ⅰ）促进免疫逃逸^[11]；在结直肠癌中，LINC01088通过吸附miR-548b/c-5p上调G3BP1，进而间接调控PD-L1表达^[12]；在NSCLC中，G3BP1通过降解信号转导及转录活化因子1（signal transducer and activator of transcription 1, STAT1）减少趋化因子分泌，抑制细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）浸润^[13]。

目前，尽管已有研究揭示，G3BP1在肿瘤免疫逃逸中具有一定作用，但针对肺腺癌这一特定亚型的相关研究仍存在关键缺口。在调控关系层面，肺腺癌中G3BP1与PD-L1的直接调控关系尚未明确。此前虽有研究报道，结直肠癌中G3BP1可通过间接途径调控PD-L1表达，但对于肺腺癌而言，G3BP1作为RBP，是否能直接结合PD-L1 mRNA，以及如何影响PD-L1 mRNA稳定性，目前仍缺乏直接的实验证据支撑^[12]。除此之外，G3BP1对肺腺癌免疫杀伤的直接作用也存在研究空缺。现有研究多聚焦于G3BP1对免疫微环境的间接调控，例如通过影响趋化因子分泌和调节MHC-Ⅰ表达等方式参与免疫逃逸，而针对其是否能通过调控PD-L1表达，进而影响T细胞对肺腺癌细胞直接杀伤效应的功能验证，尚未有相关研究报道^{[11, 13]}。

针对上述研究的不足，本研究在肺腺癌细胞中结合RNA免疫共沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation, RIP）实验、免疫荧光-荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）实验和RNA稳定性实验证实，G3BP1可直接结合PD-L1 mRNA并增强其稳定性，与膀胱癌和结直肠癌中G3BP1的间接调控通路形成区别；在功能验证上，通过构建G3BP1过表达和G3BP1敲低的肺腺癌细胞模型，结合T细胞杀伤实验，明确G3BP1-PD-L1轴与肺腺癌细胞免疫杀伤的直接关联，为G3BP1成为肺腺癌免疫治疗新靶点提供依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

人肺腺癌细胞株A549和H1975均购自美国标准培养收集所（American Type Culture Collection, ATCC）。一抗包括兔抗人G3BP1、PD-L1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）单抗均购自美国CST公司。Lipofectamine^TM 3000购自美国Invitrongen公司。G3BP1-shRNA（包括G3BP1-shRNA1和G3BP1-shRNA2）及其阴性对照NC-shRNA重组慢病毒质粒购自上海英骏生物技术有限公司。真核过表达质粒pcDNA3.1-G3BP1及其对照质粒pcDNA3.1购自上海吉玛制药有限公司。MagnaRIP® RBP免疫沉淀试剂盒购自美国Millipore公司。

1.2 细胞培养和转染

将A549和H1975细胞接种于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养液的细胞培养皿中。细胞长期培养在含5% CO₂的37℃湿润培养箱中，当细胞融合度达到80%~90%时，使用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代培养。根据Lipofectamine^TM 3000说明书中操作方法将G3BP1-shRNA1、G3BP1-shRNA2和NC-shRNA转染H1975细胞，分为shNC组、shG3BP1#1组和shG3BP1#2组，收集转染6 h后的细胞，其中shG3BP1#1组shRNA靶序列为5’-TTAGTCTTTCACTTCCAATTT-3’，shG3BP1#2组为5’-AGTGCGAGAACAACGAATAAA-3’。将稀释的过表达质粒pcDNA3.1-G3BP1及其对照质粒pcDNA3.1与Lipofectamine^TM 3000混合液转染至A549细胞中，分别为G3BP1 OE组和Vector组，收集转染6 h后的细胞。

1.3 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）检测G3BP1和PD-L1的mRNA水平

采用总RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取细胞的总RNA，使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）逆转录成cDNA模板。以cDNA作为模板，在冰上进行定量PCR体系添加，使用PrimeSTAR MAX Premix试剂盒（Takara Bio公司，日本）扩增G3BP1、PD-L1（CD274）和内参基因GAPDH。扩增条件：95℃ 10 min预变性，95℃ 15 s变性，60℃ 1 min退火/延伸（45个循环）。使用2^-ΔΔCT方法计算G3BP1和CD274相对表达量。G3BP1正向引物为5’-CGGGCGGGAATTTGTGAGA-3’，反向引物为5’-TCTGTCCGTAGACTGCATCTG-3’。CD274正向引物为5’-TATGGTGGTGCCGACTACAA-3’，反向引物为5’-TGCTTGTCCAGATGACTTCG-3’。GAPDH正向引物为5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反向引物为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.4 蛋白质印迹法检测G3BP1和PD-L1的蛋白水平

通过蛋白提取试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）提取细胞总蛋白，使用BCA法检测蛋白浓度和质量。将蛋白在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）电泳后转移到聚偏氟乙烯[poly(vinylidene fluoride), PVDF]膜上，PVDF与封闭溶液在室温下孵育以阻断非特异性结合，膜与G3BP1、PD-L1和GAPDH一抗（稀释比例均为1∶1 000）4℃下过夜孵育后，加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的山羊抗兔二抗（Thermo Fisher Scientific，美国；稀释比例1∶10 000）室温下孵育2 h后，增强化学发光（enhanced chemiluminescence, ECL）显色系统中显影，分析条带。

1.5 免疫荧光-FISH实验

将细胞接种在共聚焦培养皿中，过夜培养，用4%多聚甲醛固定15 min和0.5% Triton X-100渗透10 min。室温下用10%小牛血清封闭1 h，与G3BP1一抗和PD-L1 mRNA FISH杂交液在4℃孵育过夜。与二抗孵育后，用PBS冲洗细胞，进行FISH，室温下将细胞与15%去离子化甲酰胺在1×柠檬酸钠中预杂交15 min。在37℃杂交缓冲液中孵育过夜。杂交完成后，37℃用15%甲酰胺在1×柠檬酸钠中洗涤30 min，此过程重复3次。最后使用含4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI）的Fluoroshield^TM封固剂（Sigma，美国）固定，PD-L1 mRNA FISH探针序列为Cy5-CCTTTCATTTGGAGGATGTGCCAGAGGTAGTTCTGGGATG-Cy5。

1.6 RIP实验

根据MagnaRIP^TM RBP免疫沉淀试剂盒说明书进行实验：细胞在RIP裂解缓冲液中裂解，离心后，上清液与抗G3BP1抗体在4℃条件下孵育过夜，再将磁珠添加到上述混合物中形成免疫沉淀复合物，纯化免疫沉淀复合物，通过RT-PCR检测RNA富集情况。

1.7 RNA稳定性实验

2 μg/mL放线菌素D处理细胞0、4、8和12 h后收集细胞，进行RNA提取，采用RT-PCR检测PD-L1 mRNA水平。

1.8 T细胞杀伤实验

使用人CD8⁺ T细胞分离试剂盒（STEMCELL Technologies，加拿大）从人外周血中分离得到CD8⁺ T细胞，将细胞培养于含有10%胎牛血清、55 μmol/L β-巯基乙醇、1%青霉素/链霉素和10 ng/mL白介素-2（interleukin-2, IL-2）的RPMI 1640培养液中，用3 μg/mL抗CD3和CD28单克隆抗体（Gibco，美国）激活CD8⁺ T细胞48 h，生成CTL。在T细胞杀伤实验中，转染成功的肺腺癌细胞株与CTL以1∶10比例共同培养48 h，然后用1×PBS冲洗细胞3次去除死亡的细胞和CTL，剩余细胞用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色。细胞结晶紫染色强度采用Image J软件分析，从4个独立的实验中分析相对细胞数。

1.9 在线数据库分析

2022年8月13日通过在线数据库癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）分析肺腺癌患者中G3BP1与PD-L1表达的相关性。利用Kaplan-Meier plotter数据库（http://kmplot.com/analysis/）^[14]分析G3BP1与PD-L1的表达与肺腺癌患者预后的关系。

1.10 统计学分析

应用SPSS 19.0统计学软件分析数据。每组实验重复3次。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验。采用Kaplan-Meier法进行生存分析。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 G3BP1促进肺腺癌细胞的PD-L1表达

TCGA数据库分析显示，526例肺腺癌患者样本中G3BP1表达水平与PD-L1（CD274）呈正相关（r=0.326，P < 0.01；图 1A）。A549细胞中，利用真核过表达质粒pcDNA3.1-G3BP1构建G3BP1过表达细胞株（G3BP1 OE组），经RT-PCR与蛋白质印迹法检测证实构建成功（图 1B~1C）。与对照Vector组比较，G3BP1 OE组PD-L1的mRNA与蛋白表达水平均上调（均P < 0.05）。H1975细胞中开展反向验证，通过转染G3BP1-shRNA1、G3BP1-shRNA2和NC-shRNA成功构建G3BP1敲低的H1975细胞株及其对照（图 1D~1E）。RT-PCR和蛋白质印迹法显示，与shNC组比较，转染G3BP1-shRNA1和G3BP1-shRNA2的H1975细胞中，PD-L1的mRNA和蛋白表达水平均下降（均P < 0.05）。

2.2 G3BP1与PD-L1 mRNA结合并增强其稳定性

免疫荧光-FISH实验显示，A549细胞中G3BP1蛋白和PD-L1 mRNA存在显著共定位现象（图 2A）。A549细胞中RIP实验表明，与对照组比较，G3BP1抗体组PD-L1 mRNA的富集程度增加（P < 0.01，图 2B），证实G3BP1能特异性结合PD-L1 mRNA。RNA稳定性实验显示，与shNC组比较，敲低G3BP1的H1975细胞中，随着时间的推移，PD-L1 mRNA的稳定性出现明显下降（图 2C）。

2.3 G3BP1抑制肺腺癌细胞的免疫杀伤作用

T细胞杀伤实验显示，与CTL共培养48 h后，H1975细胞中，与shNC组比较，shG3BP1#1组和shG3BP1#2组中肿瘤细胞数量均减少（均P < 0.01，图 3A），表明G3BP1表达水平降低可增强肿瘤细胞对T细胞杀伤的敏感性。而过表达G3BP1的A549细胞的肿瘤细胞数量较Vector组增多（P < 0.01，图 3B），表明G3BP1通过抑制人淋巴细胞的杀伤功能降低肺腺癌细胞的免疫原性。

2.4 G3BP1和PD-L1高表达预示肺腺癌患者预后不良

Kaplan-Meier plotter数据库中，以系统自动计算的最佳cutoff值为分界，将G3BP1和PD-L1表达量高于该值的肺腺癌患者定义为高表达组，其余患者为低表达组。G3BP1和PD-L1高表达的肺腺癌患者均较相应低表达患者总生存期（overall survival, OS）和初次进展期（first progression, FP）均缩短（均P < 0.01，图 4）。

3 讨论

全球范围内，肺癌已成为严重威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一。统计数据表明，NSCLC约占新确诊肺癌患者的80%^[15]。其中，肺腺癌作为最常见的病理亚型，约占所有NSCLC病例的50%，且其发病率呈逐年上升态势^[16]。肺腺癌起源于支气管黏膜上皮，具备显著的高度浸润性与破坏性生长特性，极易侵袭血管和淋巴系统，致使血液与淋巴转移快速发生，临床病程进展迅猛。尽管当前针对肺腺癌的治疗方案涵盖手术、放化疗、靶向治疗和免疫治疗等多种手段，但整体治疗效果仍差强人意，患者5年OS率长期处于较低水平^[17-19]。因此，深入剖析肺腺癌发生和发展的精确分子机制，对于实现疾病的早期诊断和优化临床治疗策略，具有至关重要的意义。

恶性肿瘤的发生与发展主要历经免疫消除、免疫平衡和免疫逃逸3个关键阶段，其中免疫逃逸作为肿瘤持续进展的核心环节，是当前肿瘤研究的重点。PD-L1作为免疫球蛋白超家族中的Ⅰ型跨膜蛋白，由CD274基因编码，在肿瘤免疫逃逸机制中发挥着枢纽作用^[20-21]。PD-L1在肺癌^[22]、乳腺癌^[23]、结肠癌^[24]和胃癌^[25]等多种恶性肿瘤组织和细胞中均呈高表达状态。其表达水平与肿瘤分期、侵袭转移能力、治疗效果和预后密切相关。本研究利用Kaplan-Meier plotter数据库对肺腺癌患者生存数据进行分析显示，PD-L1高表达的肺腺癌患者OS和FP短于低表达患者，表明PD-L1高表达预示患者预后不良。然而，PD-L1表达调控机制复杂，涉及转录、转录后和翻译后等多个层面。深入探究PD-L1表达调控的分子机制，将为研发新一代抗肿瘤免疫治疗药物提供关键理论依据，对推动肿瘤精准治疗具有重要意义。

G3BP1是一种能与Ras-GTP酶激活蛋白的SH3结构域特异性结合的多功能蛋白，广泛参与细胞生长、转移、分化和凋亡等重要生物学过程，在调节mRNA稳定性和介导应激颗粒形成等方面发挥关键作用^[26-27]。近年来，大量研究聚焦G3BP1在肿瘤发生和发展中的作用。G3BP1蛋白在肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤组织和细胞系中呈高表达^[28-31]。在肺癌细胞H1299中，下调G3BP1表达能够抑制Src/黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）信号通路，进而抑制肺癌细胞的生长、迁移和侵袭^[32]。本研究发现，肺腺癌组织中G3BP1高表达患者预后较差。为进一步探究G3BP1在肺腺癌中的作用机制，本研究成功构建G3BP1过表达的A549细胞株和G3BP1敲低的H1975细胞株，并开展T细胞杀伤实验。结果显示，过表达G3BP1可抑制肺腺癌细胞的免疫杀伤作用，而沉默G3BP1则能增强免疫杀伤效果。上述结果表明，G3BP1与肺腺癌的发生和发展密切相关，抑制其表达有望增强T细胞免疫活性，为肿瘤免疫治疗提供新的潜在靶点。然而，G3BP1抑制肺腺癌细胞免疫杀伤的具体分子机制仍有待深入研究。

T细胞表面PD-1与其配体PD-L1结合后，可抑制机体细胞免疫应答，为肿瘤细胞免疫逃逸创造条件。为探究G3BP1与PD-L1在肺腺癌细胞免疫杀伤中的关联，本研究首先通过TCGA数据库对526例肺腺癌患者样本进行分析发现，G3BP1表达水平与PD-L1呈正相关。进一步通过细胞水平实验验证，在构建的G3BP1过表达肺腺癌细胞株中，PD-L1蛋白表达上调；而在G3BP1沉默细胞株中，PD-L1表达水平降低，证实G3BP1对肺腺癌细胞PD-L1表达具有正向调控作用。基于G3BP1作为RBP的特性，综合运用免疫荧光-FISH、RIP和RNA稳定性检测等发现，G3BP1能够直接结合PD-L1的mRNA，并增强其稳定性。这表明，G3BP1通过稳定PD-L1的mRNA促进PD-L1蛋白表达，实现对肺腺癌细胞免疫杀伤的抑制作用。

综上所述，本研究揭示，G3BP1通过稳定PD-L1 mRNA协同调控肺腺癌细胞免疫逃逸的新机制。这一发现为解析肺腺癌免疫逃逸的分子机制提供崭新视角，为靶向G3BP1的新型免疫治疗策略奠定坚实的理论基础，有望推动肺腺癌精准诊疗领域的突破性进展。值得关注的是，靶向G3BP1的免疫治疗策略构建了“机制-靶点-药物-标志物”的全链条转化路径。随着临床前研究的深入和临床试验数据的持续积累，G3BP1靶向药物有望嵌入肺腺癌免疫治疗的核心体系，成为连接基础研究与临床应用的关键枢纽，为实现肺腺癌的个体化精准治疗开辟全新路径。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突