目前的流行病学资料指出，大肠癌在全世界范围内年发病率位列所有恶性肿瘤第3位^[1]。肥胖与大肠癌关系密切。脂联素是一种经胰岛素刺激由脂肪组织分泌的特异性血浆激素蛋白，参与糖代谢与脂肪代谢，与肥胖和胰岛素抵抗的发生密切相关^[2]。已有研究表明，脂联素可以直接通过抑制细胞生长，如通过大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（rat sarcoma viral oncogene homolog，RAS）信号传导^[3]和诱导凋亡在大肠癌的发展中起保护作用^[4]。一项探讨循环脂联素浓度与大肠癌风险之间关联的前瞻性研究观察18 225例男性血浆脂联素水平发现，血浆脂联素水平与大肠癌危险度呈负相关（RR=0.42，95%CI：0.23~0.78，P=0.01）^[5]。本实验旨在研究脂联素对大肠癌细胞的增殖和侵袭能力的影响，探索其可能的作用靶点及机制。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

重组人脂联素购自美国PEPROTECH公司；基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）和E-钙黏附蛋白（E-cadherin，E-cad）购自北京Sino Biological Inc；Ezrin蛋白购自美国Santa Cruz Biotechnology。

1.2 细胞培养

大肠癌细胞株LoVo细胞购自浙江大学肿瘤研究所。以LoVo细胞为研究对象，设置空白对照组及4个浓度梯度组（2.5、5、10和20 μg/mL脂联素）。

1.3 细胞实验 1.3.1 MTT法检测细胞增殖抑制率

培养LoVo细胞至指数生长期，制成单细胞悬液后以4×10⁵个/mL密度接种于96孔板，待细胞贴壁后加入重组人脂联素使孔中终浓度为2.5、5、10和20 μg/mL（2.5 μg/mL脂联素组、5 μg/mL脂联素组、10 μg/mL脂联素组和20 μg/mL脂联素组），同时设空白对照组，每组设3个复孔，培养24 h，弃上清液，加入90 μL新鲜10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）培养液，再加入10 μL噻唑蓝（thiazdyl blue tetrazolium bromide，MTT）溶液，继续培养4 h后弃上清液，每孔加入100 μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），低速振荡10 min，于酶联免疫检测仪490 nm处测量其吸光度（absorbance, A）值。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组细胞A值平均值/对照组细胞A值平均值）×100%。

1.3.2 Transwell小室实验检测细胞侵袭能力

在transwell下室面铺纤维黏连蛋白，上室面包被Matrigel 1∶8稀释液，4℃过夜，超净工作台风干，紫外消毒灭菌；吸出培养板中残余液体，每孔加入50 μL含10 mg/mL牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）的无血清培养液，37℃孵育30 min，形成无基质胶transwell小室。再将LoVo细胞撤血清饥饿12~24 h，0.25%胰酶消化细胞，用含10 mg/mL BSA的无血清培养液重悬，使终密度为5×10⁵个/mL。取细胞悬液200 μL加入小室，同时加入500 μL含不同浓度（2.5、5、10和20 μg/mL）重组人脂联素的FBS培养液，对照组加入等量FBS培养液，24 h后取出小室，甲醇∶冰醋酸（3∶1）固定15 min后用10%Giemsa染色15 min，再用棉签将表面的细胞擦拭去除，然后在10×20倍光学显微镜下随机选取5个视野细胞计数。

1.4 Western Blot法检测E-cad、MMP-9和Ezrin蛋白表达

收集指数生长期LoVo细胞，不同浓度（2.5、5、10和20 μg/mL）重组人脂联素处理24 h后，裂解和离心后提取总蛋白，Lowry法测浓度。提取蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，随后电转印至硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜，分别加入按合适比例稀释的不同分子作为一抗，室温振荡反应1 h，再加入不同的酶标抗体，室温振荡反应1 h，以PBST洗膜3次，每次5 min, 最后加入四甲基联苯胺（tetrabenzidine，TMB）显色液，避光显色至出现条带，记录结果。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件分析数据。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 脂联素抑制LoVo细胞增殖能力

通过MTT实验发现，2.5、5、10和20 μg/mL的重组人脂联素处理24 h后，LoVo细胞增殖均受到抑制，与空白对照组比较，差异均具有统计学意义（均P < 0.05，表 1，图 1）。组间两两比较显示，20 μg/mL脂联素组细胞增殖抑制率高于其他各组（均P < 0.05），10 μg/mL脂联素组细胞增殖抑制率高于2.5 μg/mL脂联素组（P < 0.05），抑制率呈剂量依赖性。

2.2 脂联素抑制LoVo细胞侵袭能力

空白对照组、2.5 μg/mL脂联素组、5 μg/mL脂联素组、10 μg/mL脂联素组和20 μg/mL脂联素组LoVo细胞穿膜细胞数分别为（329±22）个、（299±17）个、（253±15）个、（174±14）个和（143±12）个（图 2A）。与空白对照组比较，不同浓度的重组人脂联素作用LoVo细胞24 h后，穿膜细胞数均减少，浓度越高，穿膜细胞数越少，组间两两比较差异具有统计学意义（均P < 0.05，图 2B）。

2.3 脂联素影响LoVo细胞增殖、黏附和运动相关分子的表达

Western blot结果显示，不同浓度（2.5、5、10和20 μg/mL）重组人脂联素作用于LoVo细胞24 h后，可诱导E-cad蛋白表达上调，诱导MMP-9蛋白及Ezrin蛋白下调，且呈剂量依赖性（图 3）。

3 讨论

大肠癌已成为最常见的消化道恶性肿瘤之一^[1]。在我国，大肠癌的发病与高蛋白/低纤维饮食及少运动等生活习惯相关，总体呈上升趋势^[6]。肥胖是大肠癌患病的高危因素^[3]。脂肪组织不仅是储存和释放脂肪的场所，也是一个具有内分泌功能的“器官”，可以分泌多种生物活性分子，其中，血管内皮生长因子、瘦素、肿瘤生长因子-α和白细胞介素-6等能促进血管生成，与多种恶性肿瘤的发生和发展正相关；但脂联素的作用相反，能抑制血管生成，调节炎性反应，与多种恶性肿瘤的发生和发展负相关^[7-9]。

现有的大肠癌治疗方法包括手术、化疗、放疗及靶向治疗等。随着化疗药物和靶向治疗药物的进步和多学科协作治疗的发展，大肠癌的治疗效果有明显提高，但肿瘤的侵袭和转移仍是大肠癌患者治疗失败的主要原因^[10-11]。因此有必要探索更多的治疗靶点为大肠癌患者带来更好的治疗效果。

侵袭和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，是多因素参与和多步骤完成的生物学过程。恶性肿瘤要实现侵袭转移首先要摆脱细胞间的粘附，才能从原发灶脱落，到达远处器官后形成转移灶^[12]。有研究表明，E-cad的表达降低，可以使基质黏附力减低，使肿瘤细胞脱离原发灶，侵犯破坏基底膜及邻近近组织及脉管，造成侵袭和转移^[13]。Ezrin是一种膜-细胞骨架链接蛋白，在细胞的运动、迁移和有丝分裂等生理作用中发挥着重要作用。Ezrin的表达可使E-cad向胞内聚集，从而减少膜表面E-cad，影响细胞间的黏附性，并使细胞间隙增宽，运动能力增强。先前有研究发现，与结直肠癌原发肿瘤比较，肝转移灶中Ezrin的表达上调^[14]；Ezrin基因敲除可抑制表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）诱导的大肠癌肺转移^[15]。MMP是一类蛋白水解酶，肿瘤细胞脱离原发灶后，通过释放这种酶降解细胞外基质，从而在肿瘤侵袭和转移中起着重要作用。MMP-9在大肠癌的浸润和转移过程及大肠腺瘤的致癌作用中也发挥着作用，与患者的预后呈负相关^[16]。本研究结果显示，脂联素可以促进E-cad的表达，并抑制Ezrin和MMP-9的表达，说明脂联素抑制大肠癌细胞的侵袭迁移可能与此有关。

综上所述，本研究通过重组人脂联素体外作用于大肠癌细胞株LoVo细胞实验，显示脂联素能有效抑制LoVo细胞的增殖及侵袭能力，其机制可能与促进E-cad表达以及抑制MMP-9和Ezrin表达有关。为进一步开展分子机制及信号通路的研究奠定基础，为开展相关治疗新靶点的深入研究和药物开发提供理论支持。