黑色素瘤是一种起源于皮肤或其他器官黑色素细胞的恶性肿瘤，具有侵袭性强、转移发生早和预后差等特点^[1]。近年来，随着免疫检查点抑制剂在肿瘤治疗中不断取得突破性进展^[2]，针对肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment, TIME）的研究也不断深入^[3]。其中，TIME内的三级淋巴结构（tertiary lymphoid structure, TLS）是免疫细胞在非淋巴器官内异常聚集形成的淋巴样结构，已在多种实体肿瘤中被发现^[4]。TLS可通过招募和活化T淋巴细胞和B淋巴细胞，促进抗原呈递和免疫记忆形成，增强抗肿瘤免疫应答反应。然而，关于TLS在中国黑色素瘤中的作用研究仍然较少。本研究旨在通过分析中国黑色素瘤患者中TLS等临床特征，探讨其与患者预后和肿瘤免疫细胞浸润的关系，以期为TLS预测患者生存预后和免疫治疗疗效提供依据。

1 资料与方法 1.1 一般资料

收集南京大学医学院附属鼓楼医院2013年2月至2021年12月初诊初治、后行原发灶手术切除的黑色素瘤病例。所有入组病例均经病理确诊，术前未接受化疗或放疗，且临床资料与随访信息完整。所有患者术前均签署相关研究知情同意书。本研究已获得南京大学医学院附属鼓楼医院伦理审查委员会批准。

1.2 方法 1.2.1 HE染色

肿瘤组织样本常温下经4%甲醛固定24 h后制成蜡块，使用微型切片机将其连续切成4 μm厚度切片，进行HE染色。所有HE染色载玻片均使用Olympus玻片扫描仪（Olympus VS2000；奥林巴斯，日本）扫描为数字化影像。2位具有中级职称以上的病理科医师在双盲条件下独立识别肿瘤内TLS。肿瘤内TLS判读标准（图 1）：（1）判读区为肿瘤病灶内；（2）出现淋巴细胞聚集灶（淋巴细胞数≥100个）；（3）TLS范围与间质区无交集^[4]。

1.2.2 免疫组织化学染色

将蜡块根据入组病例病理结果制作为组织芯片，采用EnVision两步法行免疫组织化学染色。主要试剂为CD3兔单抗（ab11089，1∶200）、CD4兔单抗（ab133616，1∶500）、CD8兔单抗（ab237709，1∶2 000）和Foxp3兔单抗（ab215206，1∶100），均购自美国Abcam公司。采用已知的阳性或对照组织作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 结果判读

细胞内呈棕色颗粒者为阳性染色（图 2）。每例均随机在肿瘤中心区观察5个高倍视野（×400），计算每个视野中阳性细胞数后取均值。

1.3 随访

患者术后每2个月通过门诊复查或电话随访生存状态，随访截至2023年5月11日，随访时间7.7~124个月，中位随访时间32.85个月，无失访事件。总生存期（overall survival, OS）定义为从手术开始到因任何原因导致的死亡时间。

1.4 统计学分析

采用SPSS 26.0软件与R软件（4.2.3）进行统计学分析。计数资料组间比较采用χ²检验或Fisher精确检验。符合正态分布的计量资料组间比较采用独立样本t检验，不符合正态分布的采用Wilcoxon秩和检验。生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制，使用R软件中ggplot2包（3.3.6）进行数据可视化。生存分析中，单因素与多因素分析采用Cox比例风险回归模型。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 临床特征

共入组78例患者，根据肿瘤病灶内是否存在TLS分为两组：存在肿瘤内TLS组38例，不存在肿瘤内TLS组40例（表 1）。存在肿瘤内TLS组中，患者年龄45~91岁，中位年龄67.5岁；男性17例，女性21例；肢端型24例，皮肤型7例，黏膜型7例；TNM分期，Ⅰ期6例，Ⅱ期16例，Ⅲ期9例，Ⅳ期2例，不明5例。不存在肿瘤内TLS组中，患者年龄40~86岁，中位年龄61岁；男性18例，女性22例；肢端型22例，皮肤型6例，黏膜型12例；TNM分期，Ⅰ期0例，Ⅱ期16例，Ⅲ期13例，Ⅳ期6例，不明5例。两组患者在TNM分期方面比较，差异具有统计学意义（χ²=11.091，P=0.026）。

2.2 肿瘤内TLS与患者OS的关系

Kaplan-Meier生存曲线显示，存在和不存在肿瘤内TLS组患者平均OS分别为53.07个月和40.69个月，差异具有统计学意义（χ²=5.413，P=0.019；图 3）。单因素和多因素生存分析显示，患者年龄、肿瘤TNM分期和肿瘤内TLS状态为影响患者预后的独立危险因素（均P < 0.05，表 2）。

2.3 肿瘤内TLS与TIME的关系

通过计算组织芯片中每平方毫米内CD3、CD4、CD8和Foxp3阳性细胞数评估TIME显示，存在肿瘤内TLS组肿瘤组织中CD3、CD4、CD8和Foxp3阳性细胞浸润数目增高（均P < 0.05，图 4）。

3 讨论

TLS有别于二级淋巴器官（secondary lymphoid organ, SLO），在生理条件下不存在，而是在慢性炎性反应环境中形成，如自身免疫疾病、异体移植排斥、慢性炎性反应与肿瘤等。目前，TLS已在多种实体肿瘤中被发现，包括乳腺癌^[5]、非小细胞肺癌^[6]、结直肠癌^[7]、胰腺癌^[8]与黑色素瘤^[9]等。经研究发现，TLS主要由B细胞、T细胞、树突状细胞和少量巨噬细胞组成。其中，CD20⁺ B细胞位于结构内部区域，CD3⁺ T细胞位于结构外周区域^[10]。CD3⁺ T细胞主要包含CD4⁺ T滤泡辅助细胞、少量CD8⁺细胞毒性T细胞、CD4⁺ T辅助细胞与调节性T细胞。树突状细胞起源于间充质，后形成不同类型亚群，包括CD21⁺滤泡树突细胞。

为了更好地研究TLS与肿瘤预后间的关系，可根据其细胞组成定义成熟度，分为早期TLS、初级淋巴滤泡样TLS和次级淋巴滤泡样TLS。高成熟度TLS能有效激活和扩增肿瘤特异性T细胞，促进B细胞产生高亲和力抗体，诱导记忆性免疫。相比早期、初级淋巴滤泡样TLS，肝细胞癌与结直肠癌患者存在次级淋巴滤泡样TLS复发风险更低^{[7, 11]}。进一步简化评估方案，可根据TLS所在肿瘤内空间位置，分为肿瘤内TLS、肿瘤边缘TLS与间质区TLS。肝细胞癌中，肿瘤边缘TLS与更高的肿瘤复发风险和更差的预后相关^[11]。研究发现，转移性黑色素瘤组织样本中存在肿瘤内TLS与良好的预后相关^[9]。本研究发现，中国黑色素瘤患者原发灶中肿瘤内TLS为判断患者预后的独立危险因素，证明肿瘤内TLS有较好的肿瘤预后判别能力。

越来越多的研究表明，TLS可以促进抗肿瘤适应性免疫反应的产生或增强^[12-13]。TLS中B细胞可通过产生肿瘤相关抗体，发挥标记抗原表达细胞的吞噬、补体介导的裂解或抗体依赖的细胞毒性作用。同时，TLS在解剖上与SLO有相似性，但是周围缺乏包膜，可能促使TLS中免疫细胞暴露在肿瘤微环境中发挥作用。在黑色素瘤小鼠模型中，TLS可诱导肿瘤特异性T细胞反应，促进免疫细胞浸润，导致肿瘤退缩^[14]。本研究也发现，黑色素瘤患者原发灶内TLS的存在提示CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞与调节性T细胞浸润增多。目前，靶向诱导或增强TLS功能的临床应用研究已逐步开展，有助于发掘TLS作为肿瘤治疗靶点的潜在价值。

总体而言，虽然TLS已在多个癌种中被证实与患者预后和免疫治疗反应相关，但我国黑色素瘤中此类研究仍较少，同时其形成机制及其在肿瘤微环境中的作用仍不明确。本研究证实，我国黑色素瘤患者肿瘤原发灶中TLS的存在提示较好的预后和TIME中更显著的免疫细胞浸润，但仍需进一步扩大样本并深入探索TLS在黑色素瘤中的作用与机制。