骨肉瘤(osteosarcoma)是一种复杂性多基因改变的疾病, 是儿童和青少年最常见的骨恶性肿瘤，发病率男性多于女性^[1]。骨肉瘤起源于间叶组织, 好发于长骨的干骺端，特别是股骨远端(43%)、胫骨近端(23%)和肱骨近端(10%)^[2]。骨肉瘤恶性程度高，易发生转移，最常见的转移部位是肺。由于目前对该病的诊治临床尚无可靠的生物标志物可以应用，约80%的患者在确诊时已发生转移^[3]，转移性骨肉瘤患者5年生存率只有10%~20%，中老年患者骨肉瘤预后更差^[4-5]。因此寻找合适的生物标志物对骨肉瘤的早期检测和预测疾病进程具有重要的意义。

近年来研究发现，RNA作为基因组的转录产物在多种疾病进程中发挥作用^[6-7]。由于RNA早期即可产生、具有一定的稳定性和丰度且可进入循环系统，其成为疾病早期检测及预测疾病进程的指标。随着测序技术、基因组学和分子生物学的进步，如circular RNA(circRNA)、long noncoding RNA (lncRNA)和microRNA(miRNA)等RNA被发现参与骨肉瘤的疾病过程，这些RNA有望成为骨肉瘤的潜在肿瘤标志物^[8-9]。本文就近年来新发现的与骨肉瘤相关的RNA生物标志物作一简要综述。

1 circRNA

circRNA具有由共价键连接的3’和5’端首尾相连的闭合环状结构，常作为分子海绵与miRNA作用调控基因表达，参与人体多种疾病的发生和发展过程^[10]。环状结构的存在使circRNA具有更好的保守性、稳定性和特异性，且丰度高，便于检测^[11]，使得circRNA成为一种新的理想的潜在肿瘤标志物。

Zhou等^[12]研究发现，Circ_0008717在骨肉瘤患者组织中表达水平增高，对45对标本作受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC) 曲线分析发现，Circ_0008717曲线下面积(area under curve，AUC)为0.782(95%CI: 0.682~0.862), 其用于诊断的特异度为0.73，敏感度为0.80；Kaplan-Meier生存曲线表明，Circ_0008717高表达组患者的总体生存率更低，无进展生存期更差；Cox多因素回归分析发现，Circ_0008717和肺转移是预后的独立影响因素；细胞实验发现，敲低Circ_0008717表达可以降低肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭性，促进细胞凋亡；Spearman相关性检验发现，Circ_0008717与miR-203负相关(r=0.785 8，P < 0.01)，可以作为分子海绵结合miR-203，miR-203类似物可以拮抗Circ_0008717的上述促骨肉瘤作用，提示其通过与miR-203的作用发挥生物效应。这些发现提示，Circ_0008717可以作为骨肉瘤诊断、预后以及治疗的潜在标志物。Zhu等^[13]研究发现，hsa_circ_0081001在骨肉瘤耐药细胞中表达高于对照组细胞，组织和血清中表达也增高；Kaplan-Meier生存分析表明，hsa_circ_0081001高表达患者的总体生存率降低，生存时间缩短；Cox多因素分析和ROC曲线分析表明，血清hsa_circ_0081001是骨肉瘤患者的独立预后影响因子，可以用于骨肉瘤的诊断(AUC=0.898，P < 0.01)和预后预测，诊断效果优于碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP；AUC=0.673, P=0.026)和乳糖脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH；AUC=0.80，P < 0.05)。另一项研究揭示了在骨肉瘤细胞中高表达的circRNA circHIPK3可以通过与miR-637反应激活信号传导及转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)通路促进骨肉瘤细胞的生长、迁移和侵袭，提示circHIPK3可能是重要的预后标志和治疗靶点^[14]。研究发现，对顺铂耐药的骨肉瘤组织和细胞中circUBAP表达升高，敲低其表达可以阻断Wnt/β-catenin信号通路，从而减少顺铂耐药的出现，同时还发现miR-506-3p通过与circUBAP反应参与这一过程，提示circUBAP可能和骨肉瘤治疗的耐药形成有关^[15]。hsa_circ_0004674在对甲氨蝶呤、顺铂和多柔比星耐药的骨肉瘤细胞和组织中表达增高，其高表达患者的预后生存时间更短，表明hsa_circ_0004674可能与化疗耐药相关，可以作为骨肉瘤治疗和逆转耐药现象的潜在靶点^[16]。

2 lncRNA

lncRNA是长度 > 200个核苷酸的几乎不编码蛋白质的一类RNA分子，可以通过和RNA结合蛋白作用调节基因表达，对于细胞的分化、增殖和凋亡具有调节作用。近年来研究发现，lncRNA表达改变和骨肉瘤等疾病的发生相关^[17-18]。

Wu等^[19]研究发现，骨肉瘤组织中LINC00324较无癌组织升高，Ⅲ/Ⅳ期骨肉瘤组织中LINC00324比Ⅰ/Ⅱ期肿瘤组织中表达升高，转移骨肉瘤组织中LINC00324表达比非转移骨肉瘤组织中表达升高；在对86例骨肉瘤患者的研究中发现，LINC00324高表达与肿瘤大小、远处转移、TNM分期、分化程度和预后生存率相关；Kaplan‐Meier分析提示，LINC00324高表达患者预后生存率更差；Cox多因素回归分析发现，LINC00324表达是骨肉瘤患者的独立预后因素(P=0.012)；细胞实验显示，LINC00324可以加快骨肉瘤细胞的增殖和迁移，其可能是通过稳定WDR66基因的mRNA在转录后水平发挥促肿瘤作用。这些结果为LINC00324作为骨肉瘤标志物提供了实验支持。有研究发现，1号染色体局部扩增lncRNA(focally amplified lncRNA on chromosome 1，FAL1)在骨肉瘤组织中表达升高，FAL1的表达水平与远处转移(P=0.008)和肿瘤分期(P=0.013)相关；血清FAL1水平、远处转移和肿瘤分期是患者生存率的独立影响因子；敲低FAL1的表达可以使肿瘤细胞停留在G₂/M期阶段；ROC曲线显示，FAL1用于诊断骨肉瘤的敏感度为87.2%，特异度为89.1%，AUC为0.839，这表明FAL1有望成为骨肉瘤诊断和评价预后的生物标志物^[20]。lncRNA KCNQ1OT1在肿瘤组织和细胞中被发现表达升高^[21]，其表达增高可以抑制miR-129-5p的表达，从而促进LA相关蛋白1(LA-related protein 1，LARP1)的表达水平，继而促进细胞增殖和产生药物抗性；而敲低其表达可以抑制骨肉瘤发生和细胞耐药的出现，这表明lncRNA KCNQ1OT1可以作为一个和骨肉瘤增殖和耐药相关的生物标志物。

3 miRNA

miRNA是1种长度在21~25个核苷酸的内源性非编码调节RNA，可以直接降解或转录抑制方式调节多种靶基因的表达，参与肿瘤的形成、侵袭、增殖和转移等多种生理和病理过程^[22]。

一项包含114例骨肉瘤患者、40例骨膜炎患者和50名健康对照者的研究显示，血清miR-124水平在骨肉瘤患者中降低，肿瘤切除后则恢复正常；其ROC AUC为0.846，血清miR-124敏感度为79.8%，特异度为86.0%；同时也显示miR-124降低与肿瘤的远处转移和临床分级相关(P=0.025 6，P=0.000 6)，5年总体生存率和无瘤生存率也更差^[23]。这些结果表明，血清miR-124是预测骨肉瘤预后的独立因素，可以作为骨肉瘤的诊断和预测转移的临床标志物。Zhao等^[24]研究发现，与邻近正常骨组织比较，miRNA-21在90.4%的骨肉瘤患者肿瘤组织中高表达，miR-221在84.0%的患者肿瘤组织中高表达，miRNA-106a在92.6%的骨肉瘤患者肿瘤组织中高表达，而miRNA143在94.7%的患者肿瘤组织中低表达；与初发患者比较，miRNA-21和miR-221在复发性骨肉瘤患者组织中表达提高(P=0.026，P=0.023)，表明两者可以用来预测骨肉瘤复发；上述4种miRNA均与肿瘤的临床分期和肺转移相关。这些结果提示，其可以作为诊断转移和预测肿瘤进程的标志物。另有研究发现，miR-455-3p在骨肉瘤组织和细胞(HOS、MG63、Saos-2和U2OS)中均降低，miR-455-3p的表达水平与远处转移、肿瘤大小和临床分级相关，miR-455-3p低表达患者的5年生存率更差；多因素回归分析表明，miR-455-3p可以作为患者临床治疗的预后生物标志物(HR=2.951，95%CI：1.124~7.747，P=0.028)^[25]。miR-615在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞HOS中降低；低表达的miR-615与肿瘤的TNM分期和淋巴结转移相关，预示着不良的临床结果和更差的预后；细胞研究显示，miR-615可以抑制HOS细胞的活力和转移，该抑制作用可以被己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)逆转，表明miR-615可以通过抑制HK2来达到抑制骨肉瘤的作用，同时可阻断上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，这些结果提示miR-615有望成为骨肉瘤的治疗新靶点^[26]。

4 P-element-induced wimpy testis(PIWI)蛋白相互作用RNA (PIWI-interacting RNA，piRNA)

piRNA是长度在24~31个核苷酸的一类非编码单链小RNA，最早在哺乳动物睾丸组织中发现，可以与PIWI蛋白反应形成piRNA诱导的沉默复合物，从而维持种系基因组的稳定^[27]。近年来有研究发现，piRNA还参与骨肉瘤等多种肿瘤的疾病进程^[28]。piR-3998被发现在骨肉瘤细胞143B和HOS中表达升高，沉默piR-39980表达可诱导细胞凋亡、染色质凝聚和核内磷酸化H2A.X组蛋白(γ-histone H2A.X，γ-H2AX)的累积，从而抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭；而过表达piR-39980可通过负向调节丝氨酸蛋白酶抑制剂B1(serine protease inhibitor B1, SERPINB1)，激活基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)，从而诱导骨肉瘤细胞的生长和迁移，提高侵袭性，这表明piR-39980可能参与骨肉瘤的进展和转移^[29]。

5 结语

骨肉瘤的RNA生物标志物研究进展见表 1^{[12-16, 19-21, 23-26, 29]}。相关研究虽然很多，但是对该病的结果改观很小，这可能是由于研究的固有缺陷和该病发病机制复杂性以及所采取的评价标准不一导致的^[1]。值得注意的是，标志物之间并非相互独立，而是既独立又相互关联，如lncRNA LINC00313敲除可以通过上调原癌基因fosl-2产物FOSL2蛋白的表达从而结合miR-342-3p，抑制骨肉瘤的发生和转移^[30]。这也说明了骨肉瘤是一个系统的且涉及多基因多通路的恶性疾病。目前这些标志物研究多数还停留在理论阶段，相信随着对骨肉瘤分子机制研究的不断深入，不久的将来会发现确切的生物标志物用于骨肉瘤的早期诊断、反映疾病进展和指导治疗方案的选择。