原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种常见的消化道恶性肿瘤。随着酒精性脂肪肝的增加和肝炎病毒的传播，我国已成为HCC发病率最高的国家之一^[1]。尽管近年来诊断和治疗技术的不断进步，但HCC患者术后的肿瘤复发及转移率仍然很高，因而导致患者5年总体生存率很不理想^[2-3]。HCC的发生与进展是十分复杂的多因素过程，涉及肿瘤本身和微环境中复杂信号传导途径的异常调节^[4-6]。因此，迫切需要找到与HCC进展相关的重要分子机制，以提高HCC的诊断和治疗效率，改善患者的生活质量。微小RNA（microRNA，miRNA）是一种19~25个核苷酸长度的非编码RNA，主要在转录后水平调节基因表达^[7]。在过去十几年中，由于miRNA在癌组织与细胞中的表达差异性，且在控制癌症发生过程中的基础作用而受到广泛关注^[8]。

近年来，研究者发现，循环miRNA是一种新型的细胞外信号分子，能在各种体液中被检测出来，如血液、乳汁、眼泪、唾液、尿液、脑脊髓、精液和腹腔积液等^[9]。基于非凡的稳定性，较不复杂的化学结构和缺乏后处理修饰，循环miRNA被认为是癌症和其他疾病的最佳生物标志物^[10-11]。循环miRNA可与血清蛋白和脂蛋白结合，也可包裹到细胞外囊泡中，包括外泌体、微泡或凋亡小体，并在细胞通讯中发挥重要作用^[12]。原发性结直肠癌患者血清中循环miR-1229的表达水平高于健康对照者，循环miR-1229可作为结肠癌诊断的有希望的生物标志物^[13]。然而，循环miR-1229在HCC诊断与预后中的价值仍然未知。本研究分析循环miR-1229在HCC血清中的表达特征，并评估其作为HCC诊断与预后生物标志物的潜在价值。

1 资料与方法 1.1 一般资料 1.1.1 仪器与试剂

常温-低温冷冻离心机购自德国Eppendorf公司。-80℃超低温冰箱购自日本SANYO公司。高压蒸汽灭菌锅购自美国Invitrogen公司。Prism 7900HT/FAST荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。NanoDrop 2000/2000c紫外-可见分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific公司。RNAiso Blood购自日本Takara公司。逆转录及qRT-PCR试剂购自美国Promega公司。

1.1.2 外周血标本

收集2006年6月1日至2012年12月31日本院肝胆外科确诊的HCC患者(HCC组）与2015年1月1日至2018年10月31日本院体检的健康者（对照组）各150例的外周血标本5 mL，常规分离血清后立即放置于液氮保存备用。HCC患者中男性87例，女性63例。年龄19~75岁，（54.36±5.70）岁；健康者中男性95例，女性55例。年龄23~59岁，（47.10±6.39）岁。所有HCC患者术前6个月内均未接受化疗、放疗或经皮消融治疗。入院后详细收集HCC患者的临床信息，包括年龄、性别、乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）水平、肿瘤体积、分化程度、TNM分期、巴塞罗那（barcelona-clinic liver cancer，BCLC）分期、淋巴结转移及远处转移等，术后随访时间为5年。本研究已通过湖南省人民医院伦理委员会审批，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法 1.2.1 RNA提取

取1 mL血清样本添加3 mL RNAiso Blood，常温静置5 min。添加800 μL氯仿溶液，常温静置5 min。在4℃、13 000 r/min条件下离心15 min，收集上清液。添加800 μL异丙醇，常温静置10 min。在4℃、13 000 r/min条件下离心10 min，丢弃上清液，保留沉淀。添加1 mL 75%乙醇溶液，常温静置5 min。在4℃、13 000 r/min条件下离心5 min，丢弃上清液，保留沉淀。添加10 μL无RNA酶去离子水溶解沉淀，静置5 min使沉淀充分溶解，将RNA定量后置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 逆转录实验

采用无RNA酶去离子水将RNA样本浓度调定为1 μg/μL。取1 μg RNA进行逆转录合成cDNA。反应总体积为10 μL，包括RNA 1 μL，逆转录试剂5 μL和无RNA酶去离子水4 μL。反应温度条件如下：70℃10 min，42℃15 min，95℃5 min，4℃5 min。将合成的cDNA放置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.3 qRT-PCR实验

取1 μL cDNA为模板进行qRT-PCR实验。反应总体积为20 μL，包括cDNA 1 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，qRT-PCR试剂10 μL和无RNA酶去离子水8 μL。反应温度条件为：95℃20 min，然后98℃20 s，58℃30 s和72℃30 s，随后进行40个循环。miR-1229上游引物为5’-GTGGGTAGGGTTTGGGGGAGA-3’，下游引物为5’-CTGTGGGAGGGCAGTGGTGAG-3’；以人U6核内小RNA（U6）为内参，U6上游引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCAC-3’，下游引物为5’-ACGCTTCACGAATTTGC-3’。反应结束后，采用2^-ΔΔCt法^[14]计算循环miR-1229的表达水平，ΔΔCt=Δ(Ct_{癌组织miR-1229}-Ct_癌组织U6) - Δ(Ct_{癌旁组织miR-1229}-Ct_{癌旁组织U6})。实验独立重复≥3次。

1.3 随访

所有患者从手术结束后开始随访，随访时间范围为60个月。采用电话方式随访，每隔3个月随访1次，主要询问患者的近期生存状况及肿瘤复发情况。若患者中途因肿瘤出现死亡，则随访结束；若患者中途失访，则将该患者记录为删失患者。生存时间定义为手术到死亡或手术到最后随访时间。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量数据采用均数±标准差（x±s）表示。通过配对t检验分析循环miR-1229在HCC和健康者血清中的表达差异。通过χ²检验分析循环miR-1229的表达水平与HCC患者临床病理特征的关系。通过Kaplan-Meier与log-rank法评估循环miR-1229的表达水平与HCC预后的关系。通过受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估循环miR-1229对HCC诊断的特异度和敏感度。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 循环miR-1229在HCC血清中的表达水平

HCC组血清中循环miR-1229表达水平高于对照组[（1.50±0.54） vs （0.94±0.39），P < 0.05；图 1A）。淋巴结转移阳性患者血清中循环miR-1229表达水平高于阴性患者[(1.85±0.48) vs (1.19±0.45)，P < 0.05;图 1B]。

2.2 循环miR-1229的表达水平与HCC患者临床病理特征的关系

根据循环miR-1229在HCC血清中表达水平的中位数值（1.48）为临界点，将150例HCC患者分为低表达循环miR-1229组（低miR-1229组）和高表达循环miR-1229组（高miR-1229组），每组各75例。高miR-1229组和低miR-1229组在淋巴结转移和远处转移方面比较，差异均具有统计学意义（均P < 0.01，表 1），但在年龄、性别、HBsAg、AFP水平、肿瘤体积、分化程度、TNM分期及BCLC分期方面比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）。

2.3 循环miR-1229在HCC及淋巴结转移状态中的诊断价值

循环miR-1229区分HCC患者与健康者的ROC曲线曲线下面积（area under curve，AUC）为0.79，敏感度为68.5 %，特异度为77.5 %（P < 0.05，图 2A）。循环miR-1229区分淋巴结转移阳性患者与淋巴结转移阴性患者的AUC为0.86，敏感度为71.9 %，特异度为82.2%（P < 0.05，图 2B）。

2.4 循环miR-1229的表达水平与HCC患者预后的关系

高miR-1229组患者5年总体生存率低于低miR-1229组患者（20.0% vs 26.7%，HR=1.47，95% CI: 1.01~2.14，P < 0.05；图 3）。

3 讨论

手术切除仍然是HCC患者最主要的治疗方法，但由于缺乏有效的早期诊断方法，仅30%~40%的患者在确诊时可行手术治疗。AFP是一种常见的用于HCC筛查的肿瘤生物标志物，但其在早期HCC筛查中的诊断效率仍不能令人满意^[15]。因此，迫切需要鉴定新型的生物标志物用于早期HCC筛查。近年来，miRNA在各种癌症的发生和发展中作为重要调节分子起作用，而受到越来越多的关注。最近，miRNA被发现在血液中以无细胞形式循环，并证实循环miRNA在HCC中具有较高诊断和预后价值^[16-17]。Guo等^[18]报道循环miR-21在HCC患者血清中高表达，与临床分期和远处转移有关，且循环miR-21对HCC具有良好的诊断价值，AUC为0.83，敏感度为81.2%，特异度为83.2%。低表达循环miR-26a/29a可作为HCC患者根治术后预后不良的标志物^[19]。循环miR-1246在早期肿瘤复发的HCC患者中表达上调，与淋巴结转移、肿瘤分化和门静脉侵袭相关，循环miR-1246对具有早期肿瘤复发的HCC具有较高的诊断价值^[20]。循环miR-101-3p、miR-106b-3p与miR-1246（单独或组合）作为HCC的诊断生物标志物也具有潜在价值^[21]。循环miRNA作为生物标志物具有如下的优点：（1）稳定性高，不易被降解；（2）肿瘤早期可检测到表达变化；（3）检测时所需样本量少，检测方法相对简单。然而，关于循环miR-1229在HCC诊断与预后中的价值仍然未知。

miR-1229位于5q35.3染色体上，在一些癌症中被发现表达失调，包括胃癌、乳腺癌和结肠癌等^[13]。循环miR-1229水平在结直肠癌患者血清中上调，并且与肿瘤大小、淋巴转移、TNM分期和预后不良相关，过表达循环miR-1229通过靶向同源域相互作用蛋白激酶2（homeodomain-interacting protein kinase 2, HIPK2）促进血管生成^[22]。miR-1229在乳腺癌中表达上调且与预后不良相关^[23]。过表达miR-1229抑制体外乳腺癌细胞增殖与裸鼠体内肿瘤生长。miR-1229过表达通过直接靶向腺瘤性结肠息肉（denomatous polyposis coli，APC）、糖原合酶激-3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK-3β）、β-连环蛋白和T细胞因子抑制物（T cytokine inhibitor，ICAT）激活乳腺癌中的Wnt/β-catenin信号通路而促进肿瘤生长。本研究通过收集150例HCC患者与150例健康者的外周血标本，采用qRT-PCR检测血清中循环miR-1229的表达水平，发现HCC患者中循环miR-1229的表达水平高于健康者，且淋巴结转移阳性患者血清中循环miR-1229的表达水平高于淋巴结转移阴性患者。该结果与已报道的研究结果一致^[22-23]。本研究还发现，循环miR-1229在Ⅰ~Ⅱ期HCC患者血液中表达升高，提示循环miR-1229对HCC早期诊断可能具有一定的参考价值。

本研究对循环miR-1229表达水平与HCC患者临床病理特征的关系的分析结果显示，循环miR-1229表达水平在淋巴结转移及远处转移方面比较，差异均具有统计学意义（均P < 0.05)，但在年龄、性别、HBsAg、AFP水平、肿瘤体积、分化程度、TNM分期及BCLC分期方面比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05)。ROC曲线显示，循环miR-1229对HCC及淋巴结转移具有较高的诊断价值，AUC分别为0.79和0.86，敏感度分别为68.5 %和71.9 %，特异度分别为77.5%和82.2%。该结果与循环miR-1229在结直肠癌中的诊断价值基本一致^[22]，表明循环miR-1229可用于HCC的诊断和区分HCC的淋巴结转移状态。目前HCC的预后监测缺乏有效的标志物。本研究发现，循环miR-1229与HCC预后相关，高表达循环miR-1229患者5年总体生存率低于低表达循环miR-1229患者，表明循环miR-1229作为HCC预后的生物标志物可能具有较高的潜在价值。本研究存在的一些不足：（1）本研究本质上是单中心回顾性研究，因此可能存在选择偏倚；（2）临床样本数量仍不够大；（3）未能将几种消化系统肿瘤作为对照。因此，本研究组计划进行前瞻性大规模和多中心研究，以进一步阐明循环miR-1229在HCC诊断与预后中的价值，目前该研究正在积极准备中。

综上所述，本研究发现，循环miR-1229在HCC中表达上调，并与淋巴结及远处转移相关。循环miR-1229对HCC及淋巴结转具有较高的诊断价值并与预后相关。高表达循环miR-1229提示HCC患者预后不良，表明循环miR-1229可能为一种新的HCC诊断与预后的生物标志物。